蛋白质结晶研究进展-姬燕培

第３５卷第９期２０１２年９月ＨＥＢＥＩ　ＨＵＡＧＯＮＧＶｏｌ．３５，Ｎｏ．９Ｓｅｐｔ．２０１２收稿日期：２０１２－０５－３０作者简介：姬燕培（１９８６－），女，硕士研究生，助教，主要从事环境监测专业的教学工作，Ｅ－ｍａｉｌ：[e-mail]。生物化工蛋白质结晶研究进展姬燕培，崔　虹（黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封４７５００３）摘　要：蛋白质结晶是研究生物大分子结构的重要手段，也是制约其发展的瓶颈。总结了蛋白质结晶的常用方法及其影响因素，并介绍了近年来蛋白质结晶发展的新技术和新手段。关键词：蛋白质结晶；晶体；进展中图分类号：Ｑ　５１文献标识码：Ａ　　文章编号：１００３－５０９５（２０１２）０９－００２５－０３Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎＪＩ　Ｙａｎ－ｐｅｉ，ＣＵＩ　Ｈｏｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｙｅｌｌｏｗ　Ｒｉｖｅｒ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｎｃｙ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋａｉｆｅｎｇ　４７５００３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｍｅａｎ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ａｎｄ　ｉｔｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ　ｉｔｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｏ　ｓｕｍｍａｒｙ　ｔｈｅ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃ－ｔｏｒｓ，ａｎｄ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ；ｃｒｙｓｔａｌ；ｐｒｏｇｒｅｓｓ　　蛋白质结晶学是１９世纪下半叶发展起来的一门科学，作为分离纯化蛋白的重要手段［１］，它精简了纯化的步骤，有效降低了生物制药方面的成本［２］。１９３０年末出现的Ｘ－射线衍射技术使蛋白质结晶有了新的应用领域，也使得结晶技术成为研究生物大分子性质和功能的重要基础［３］。获取合适的晶体是进行Ｘ－射线衍射分析以确定蛋白质结构的前提，由于生物大分子的特殊性，培养适合衍射分析的晶体仍是制约这一领域发展的瓶颈［４］。因此，研究蛋白质结晶过程的机理，改进结晶技术和优化结晶条件对培养出适合衍射分析的晶体具有重要意义。１　蛋白质结晶常用的技术方法目前，培养蛋白质晶体的方法主要有批量结晶法、蒸汽扩散法、液－液扩散法和透析结晶法４种［５］。１．１　批量结晶法批量结晶法是最古老的结晶方法，关键是控制所加沉淀剂的量，以使蛋白质溶液逐步达到低过饱和，所用体积一般为５０μＬ到几毫升之间。当溶液未达到过饱和状态时，沉淀剂的量对低过饱和状态影响不大，但到临界状态时，沉淀剂的量难以控制。为克服该困难，可配制一系列蛋白质浓度递减和沉淀剂浓度递增的溶液以选择最佳的结晶条件［６］。现在逐渐发展起来的微型化的批量结晶法，即微池法，所需溶液量很少，一般为１～２μＬ。目前，微池法中液滴的不同组分可通过与计算机联用的微分布器实现自动调节，省去了大量的手工操作，而且能够精确地控制结晶条件。１．２　蒸汽扩散法蒸汽扩散法［６］是指使某种蛋白质结晶所需盐的河北化工　　Ｈｅｂｅｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ第３５卷浓度与略低于这种盐浓度的蛋白质溶液在一个封闭体系内蒸发扩散，最后达到平衡，液滴中盐浓度增加而蛋白质浓度溶解度降低，达到过饱和度而结晶。根据实验方法的不同，蒸汽扩散法又分为悬滴法和座滴法２种，其结晶原理完全相同。１．３　液－液扩散法液－液扩散法［７］即自由界面扩散法。蛋白质溶液（约１０μＬ或更多）和沉淀剂溶液分别置于毛细管的两端，这２种溶液在毛细管中通过扩散达到平衡，晶体将在最佳浓度梯度的某个位置生长。１．４　透析结晶法透析结晶法［６］是利用半透膜允许小分子通过而不允许大分子通过的性质，调节蛋白质的浓度，使蛋白质溶液逐渐接近低过饱和度的方法。具体做法是将蛋白质溶液装入透析袋，放入盛有高浓度盐的透析液中。这种方法的优点是可以改变结晶的条件以控制扩散速率，从而慢慢达到成核结晶点，缺点是限制了某些沉淀剂的使用，如ＰＥＧ等［８］。上述几种结晶方法各有利弊，实际应用中结晶方法的选择主要依据所选蛋白种类、结晶要求以及实验者的偏好而定。蒸汽扩散和批量结晶相对其它方法具有简便易行的特点，并且这２种方法已经实现了自动化［９］。２　蛋白质结晶的影响因素影响蛋白质结晶的因素众多，大致可归为物理因素、化学因素和生物化学因素３大类［１０］。物理因素主要有温度、压力、时间、电场和磁场、重力等；化学因素包括ｐＨ值、蛋白质浓度、沉淀剂种类和浓度、离子强度、过饱和度等；生物化学因素有蛋白质的纯度、来源、等电点、添加剂、样品的聚集体等。下面具体介绍几种对蛋白质结晶影响较大的因素。２．１　蛋白质纯度的影响蛋白质的纯度越高，结晶的可能性越大而且晶体的质量越好，通常情况下蛋白质的纯度不应低于５０％。杂质的存在不仅会影响微晶的形成和单晶的生长，而且还能与待结晶的物质络合生成无序聚合的沉淀物，影响晶体的正常生长［１１］。此外，杂质还可能粘附到晶体表面或者进入晶体内部，从而降低晶体的纯度和衍射分辨率［１２］，对实验造成不利的影响。所以培养蛋白质晶体最重要的是分离、纯化并获得均一的样品，样品纯度一般要达到电泳纯。２．２　过饱和度的影响溶液的过饱和度指的是过饱和溶液的实际溶解度与饱和溶液溶解度之间的化学势的差值，是蛋白质结晶的驱动力和控制晶体成核和生长的关键因素。当过饱和度较小时，晶体的成核及生长速度较慢，容易得到数目少且尺寸大的高质量晶体，但晶体的生长周期比较长；当过饱和度过大时，蛋白质分子生长速率过快，会发生分子聚合现象，导致出现沉淀。晶体生长的最佳区域应该是在饱和区和过饱和区之间的亚稳定饱和区域内。在该区域，溶液的过饱和度不足以引起生成新的晶核，但是已形成的晶体可以继续生长［１３］。２．３　ｐＨ值的影响蛋白质是两性物质，溶液的ｐＨ值能够改变其分子表面的电荷分布，因此绝大多数蛋白质对溶液的ｐＨ值变化非常敏感。一般来说，蛋白质分子表面所带的电荷越高，它的溶解度越大，当纯电荷为０时溶解度最小［６］。调节ｐＨ值可以改变晶体的大小和形状，如果不考虑晶体特定的晶型，ｐＨ值可以在较宽的范围内进行，但是考虑特定的晶型则对ｐＨ值的要求比较严格，通常其波动范围不能超过１．０［１４］。对于大多数蛋白质来讲，ｐＨ值应选择在其等电点附近。２．４　温度的影响温度对蛋白质的溶解度有较大的影响，是蛋白质结晶过程中必须考虑的重要因素。一般来说，低离子强度下蛋白质的溶解度随温度升高而增大，而高离子强度下则随温度升高而降低［１５］。不同蛋白质适合其结晶的温度不同，大多数蛋白质结晶的温度都在４～２５℃之间。通常温度过高会使扩散速度加快，从而形成较多的晶核，不容易长成大晶体。对于同一蛋白质分子来说，结晶温度不同，所得到的晶体形貌、质量也有很大差别。２．５　沉淀剂的影响作为结晶助剂的沉淀剂，主要作用是对溶剂（水）的影响而非对蛋白质分子的影响［１６］。沉淀剂可分为盐类和有机类２种。盐类沉淀剂主要是破坏蛋白质的水化层，减小蛋白质与水的结合能力，增大蛋白质和蛋白质的结合能力。有机类沉淀剂的基本功能是降低溶质的介电常数，使它们之间的静电排斥力与它们的极性减弱［１７］。常见用于蛋白质结晶的沉淀剂主要有氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、聚乙二醇、乙醇、丙酮等。沉淀剂浓度不仅能影响晶体的成核，还能影响晶体的生长过程［１８］。当沉淀剂浓度过大，会增大溶液的过饱和度，晶体生长速率过快，导致晶型较差，甚至发生多晶态现象；沉淀剂浓度过小，则生长比较缓慢，虽然得到的晶体质量较好但比较耗时。在结·６２·第９期姬燕培，等：蛋白质结晶研究进展晶过程中，要综合考虑各方面因素优化沉淀剂浓度以得到最优的效果。２．６　添加剂的影响在结晶过程中添加一些小分子化合物或者有机试剂作为添加剂，往往会收到意外的效果，如改善晶体形貌，增大晶体尺寸，使所得晶体更适合Ｘ－射线衍射分析，提高Ｘ射线衍射质量，扩充衍射限制等［１９，２０］。常用的添加剂主要有醇类、ＤＭＳＯ、聚乙二醇以及一些聚合物等。添加剂在生物大分子结晶中应用得非常广泛，不仅适用于蛋白质的结晶，也能用于核酸的结晶。与沉淀剂对结晶的影响类似，对于不同种类的蛋白质，有积极作用效果的添加剂种类也不同，即没有一种适合所有蛋白质结晶的物质，这就需要在实验过程中不断摸索，找到适合目标蛋白的添加剂以得到最佳的结果。截至目前，虽然添加剂技术在蛋白质结晶中必不可少，但其作用机理尚无统一定论，有待深入研究。３　蛋白质结晶的发展前景影响蛋白质结晶的因素有很多，蛋白质在结晶过程中对外界环境非常敏感，但是通过扩大筛选条件，控制和调节结晶过程中的关键因素，获得适合衍射分析的高质量晶体还是可行的。但不可否认的是，蛋白质结晶仍然是一项艰难的工作，特别是对一些未知结构的蛋白，如膜蛋白。近年来，由于独特的物理化学性质和生物兼容性，离子液体用于蛋白质结晶并发挥着越来越重要的作用。离子液体具有很强的设计性，其极性、水溶性、溶解度、熔点、稳定性等物理化学性质不仅可以通过阴阳离子的种类和取代基进行调控，也可以通过控制阴阳离子的大小和极性进行修饰，这为蛋白质结晶条件的筛选提供了很大的选择空间。因此，未来几年，离子液体作为一种新型的结晶试剂将会有非常广阔的发展前景。参考文献［１］Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ　Ａ．Ａ　ｂｒｉｅｆ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ－ｎａｌ　ｏｆ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ，１９９１，１１０（１－２）：１－１０．［２］Ｊｕｄｇｅ　Ｒ　Ａ，Ｆｏｒｓｙｔｈｅ　Ｅ　Ｌ，Ｐｕｓｅｙ　Ｍ　Ｌ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｍｐｕ－ｒｉｔｉｅｓ　ｏｎ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉ－ｎｅｅｒｉｎｇ，１９９８，５９（６）：７７６－７８５．［３］Ｃｌａｉｒ　Ｎ　Ｓ，Ｓｈｅｎｏｙ　Ｂ，Ｊａｃｏｂ　Ｌ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓ－ｔａｌｓ　ｆｏｒ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，１９９９，９６（１７）：９　４６９－９　４７４．［４］Ｈａｒｒｉｓ　Ｔ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｔｏｄａｙ，２００１，６（２２）：１　１４８．［５］ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ　Ａ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｒｙｓｔａｌｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，１９８２：１２５－１３６．［６］卢光莹，华子千．生物大分子结晶学基础［Ｍ］．北京：北京大学出版社，１９９４：４．［７］Ｃｈａｙｅｎ　Ｎ　Ｅ．Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａ－ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ，１９９９，１９８：６４９－６５５．［８］Ｂｅｔｈ　Ｍ，Ｂｒｏｏｍ　Ｈ，Ｗｉｔｈｅｒｏｗ　Ｗ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｏｂｓｅｒｖａ－ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｏｌｕｔａｌ　ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ