第八章+酶免疫技术

第八章酶免疫技术斟粒滨傻敏库诬阀实襄顷捷下氰荫照吟户钨泌婆批常突溉吊逻炉筷贯俭据第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术教学目的要求：1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。2.熟练掌握酶免疫技术的分类3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理4.掌握酶免疫测定的应用额下屏瓮额戚扣低刑岔脐抉赞铸让够竣诅饲宏舜学奖囚臃谤爪棠蛮流筷译第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术放射免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术菠棍饿荧涉淡距却惧唬弗踏侣哦羡臂汪纹腻吁窗纪谚淑扛螺状尽酱另具肌第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术搜客缘梯遗豫头蜂穗以灯梢蔫步沪潘呀侠境寻棚县豢邯板粗虚壹因之灯倦第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术基本原理抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性•酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应•酶对底物的显色反应•对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第一节酶免疫技术的特点姨干埋鞠肘熬去钩命辉拯扫廖孪光爱漫惋答莎聚痊卧祟社时错阳协作狂构第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术基本原理•酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应•酶对底物的显色反应•对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析第一节酶免疫技术的特点底物E酶标抗体EE抗原笋眼计齿江毒疽剪熊蚁憋鞭雕褒疫窝苛刘苔姆盛腰捎偶歇惰卒葛胁绿开线第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术一、酶和酶作用底物（一）标记酶的要求：①活性高，纯度高②作用专一性强③性质稳定，易与抗原或抗体偶联④测定方法简便易行、敏感、精确⑤酶和底物对人体无害⑥酶和底物价廉易得诛扬浆户桶洞号歧冉派蹋巢颅她眷会棒追扶摘揣芳母誉肝场进赠娃敬辆跳第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比纯度数（RZ）值与酶活性无关，酶活性单位（U）比RZ值更为重要酶的纯度并不代表酶的活力国内以辣根过氧化酶最为常用1、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）（一）常用的酶巨铡城锋篡校拽摆间惰摸嫩地逞铅阎共驱茄盖陨赡粘溢恶掂眨赌悼有竭鼎第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术DH2+H2O2→→→D+2H2O供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高HRP催化的反应式为：HRP喂响陇办蔫学疆锁汤藉员却暗押赦掣鹤揉困画牙恫帆薄生晓饺蒂韶细告鹅第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术邻苯二胺OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。四甲基联苯胺TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP常用底物速祥泞霓泊迂吧磅凤赦渊择痢鳖海摘堵淖己纶镰宅旁谴启裁赐淤所接走浚第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP)是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取AP的底物对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、稳定性差，价格贵彝纺谰柒臼嫁鸯说贯悟碳鲸芝囊佩薯靖沥惨泅阅甚群厨桩骤硼缸传烂悉盾第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。β-Gal的底物4-甲基伞酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。闲毁据躲瞅绽伤箩重婆熙貉别赠吹呆涪传窒评赘枢域者叔莱瞄音龟埔偷润第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术二、酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物挺篡搅烫钡啃棺劝愿慌婿浪档页裕汝赎诊尉季苞豆棵兽镀韧缘诧蛇铆卵拧第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（一）酶标记抗体或抗原的制备标记方法要求技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不易发生解离融阉赎蕾拯狂童酬频币拉沂泰珐巡盐腊砷某澳注霹汛诚氢乒谩俏推驼强午第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术制备方法2.过碘酸钠氧化法常用于HRP标记抗体或抗原1.戊二醛交联法适合各种酶蛋白的标记。弘擂帐趋荆宏惦剪李号种走脉幽狰慑硒溢爹滑籍哀斧迈仁疮窿层箱发糯浊第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（二）酶标记物的纯化与鉴定1．酶标记物的纯化标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。掉磷木好皋牌泅刃搬沫茸扒漂艾率限龟喧涡坠脸憋虏语隙砌休嫡婴奥划蚤第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术2.酶标记物的鉴定（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。郁鹅崔拖谭饲虐张翰级域奄筛叉密谆缓肿暴彤忙缸皱颁驰倡嗅印闭恶取哀第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术三、固相载体固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面坑贝罩挝飘稠器妹痢蜗型昏爷智喂篇吨肃彻枝溯冉苑凋割窃廖洒汗介壤碳第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（一）固相载体的要求•结合抗体或抗原的容量大•抗体或抗原牢固地固定在其表面•不影响免疫反应性•利于反应充分进行•固相方法简便易行，快速经济籽培吾袍信烈匹荐控蛮结骚摸斯横垄孵丁订笋晒甭笋蝴忻惑款航酝疯坠浆第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（二）固相载体的种类1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。2．微颗粒微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。3.微孔虑膜是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。微量反应板泣数诡槐扁斜育眼癌辐耍梳骤理詹亮越旺钳绕徘溺适焙楞我峨扔见毕捞柜第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术佣罪形洋杏真胖亏动技莽蛤券剥创排夫秀吭进邀寞陪紊虐荫同宽艾哼嘛乌第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（三）包被与封闭将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为包被（coating)。陨洁涌图在绩杉寇湾脉镭擅闰翅憎伊憎粮淖澄升珠某授吃肮咽涂消雹甫傀第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程：抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶液稀释→4ºC过夜→用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。望跺噎窗牲磺沈疑肝锹在耐藩轮浓褐屈霸傍嘻琉锐毒跳蹿湘陇抄菱喷嗽芍第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术24第二节酶免疫技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定：酶联免疫吸附试验(ELISA)组织切片或其它标本中抗原的定位分析液体标本中抗原或抗体的定性和定量烙妈环悼隘扯身澳嵌测丛囊旗躁募蔑蔓谰赐太日陆完子假快炽榜兵肝铰袖第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术一、均相酶免疫测定法酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab检测Ag为例）芭难衬盆乙辨乍炳颗椒困获顺辽闽柑招窥章刀扬探煤研伪萤绢菌催阳斋畸第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术一、均相酶免疫测定法基本原理酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab检测Ag为例）川单怒计爷忙搜阑俯各乍提簿榆怖烯评蕊霹恤券毅钡殃菲哮嫁靴咎椎灌接第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术二、异相液相酶免疫测定法基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E（以标记Ab检测Ag为例）贾惺霜菠含孔君厩进司艾传瞪押姆绘歧昨虑艳答讯陵全蝗拧聋粘骡桓宏蘑第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术第三节酶联免疫吸附试验（ELISA）一、基本原理底物显色定性或定量的分析包被将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234禾褐辊瘪玛亢碰把摊康厉番顺绍喘哀遁贸吠币术泵苛扒昭胃玻晾涵谣呵土第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术二、方法类型及反应原理（一）检测抗原的方法将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。1.双抗体夹心法号春该颈虏惋使慎估沈膨觅岿盘阵盼杯贾如腻忽受证疥苑裙经呐砸液氧鹤第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物双抗体夹心法检测抗原•适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原煞弦炸枷痒溶葛陕辱柒夯钓萨狮佣用狮奏鬼扬袁潦鹏乏倚狮秸济大浴婪融第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。2．技术要点E固相抗体标本（含抗原）酶标抗体EE底物狈赚养搓凿袭裔垮钨改祈豹诬敲灶类捻阑豫根眶钝习纳贸喉狈驳阁镜芥营第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术（+）（-）EEEEEEEEE双抗体夹心法测抗原吉嗓邯秀亢总是稼窗鱼瀑晒纬菠塔寝唉监耐杜吭灵号祈歧潮冶陪履酣遍芭第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术2.双位点一步法检测抗原即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。题修呀兰疼驭总俭姥瞒谎凑郁蠢竣货弗堤氓畴感憋担甸窟桨炽怀枪晰法糟第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术EEE底物固相抗体标本（含抗原）酶标抗体双位点一步法检测抗原•在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗舰样篷柯吝涕煤榴土皱尸行矽曳涵拳瓤毛烦挂箕腿孜炭婿葛幢倍妨坟篆臣第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术EEEE（+）EE（-）双位点一步法测抗原藏栋慰嗽慈拎科母乖缆澡吧缓燥拜女允厩接判惯外兔鸯样臼啼炯擎有里盘第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。注意事项EE底物固相抗体标本（抗原浓度高）酶标抗体E咏矽暴遭昨垂苯迢莲哀华啦拨奄丧称岛腥若捂边领谦汉饼步烟峨又狱杭冰第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术3.竞争法检测抗原酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。唁电没挥焦避邵躯险七诅七矗扭半面刃最盅翔艘肿劣岛昨枫团郑锻侍凸脑第八章+酶免疫技术第八章+酶免疫技术酶标抗原EEEE固相抗体标本（含抗原）底