微生物菌种的筛选、诱变与保存技术

微生物实验技术第四章微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术实验4-1降解苯酚微生物的选育实验4-2紫外线诱变育种实验4-3微生物菌种的保藏方法实验4-4苏云金杆菌的虫体复壮实验4-1降解苯酚微生物的选育一、实验目的1.学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。2.学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。二、实验原理酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。实验4-1降解苯酚微生物的选育三、实验材料1.菌源含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。2.培养基耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面)，碳源对照培养液a，苯酚培养液b，见附录Ⅲ。3.试剂2%4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液,1%淀粉溶液，（见附录Ⅴ）。4.其他稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。实验4-1降解苯酚微生物的选育四、实验方法1.采样自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌瓶中，带回实验室，记录采样日期、地点，曝气池的水质分析包括：挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。采集的样品应迅速稀释分离。实验4-1降解苯酚微生物的选育2.分离纯化梯度平板制备：在无菌培养皿中，先倾倒7～l0mL不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基，将培养皿一侧置于木条上，使皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入无菌7～l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基，刚好完全盖住下层斜面，放置过夜。由于苯酚的扩散作用，造成上层培养基由厚到薄的药物浓度递减的梯度(图4-1)。实验4-1降解苯酚微生物的选育图4-1梯度平板实验4-1降解苯酚微生物的选育涂布法分离：将采集的样品按涂布法分离，30℃培养2天后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，苯酚低浓度区形成菌苔，苯酚高浓度区出现稀少菌落，将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，30℃培养2天。实验4-1降解苯酚微生物的选育3.耐酚菌驯化先将从含酚废水采集的活性污泥放入含酚量小于l00mg/L含酚废水中，添加0.3%MgSO4·7H2O、0.3%KH2PO4，30℃振荡培养6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再流加含酚废水，使苯酚浓度增加至200mg/L，30℃振荡培养4～6天；再提高到流加250mg/L含酚废水，30℃培养4天，从中选出对酚耐受力强的菌株。实验4-1降解苯酚微生物的选育4.性能测定。初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度为0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，将选出的耐酚力强的的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为酚降解力高的菌株。复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯酚培养液b中，30℃振荡培养48h，0、12、24、36、48h取样测A600光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源(葡萄糖)培养液为对照。若与对照相比，在250mg/L苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显，同时，用4-氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若苯酚降解率达80%，表明确系分离到有效苯酚降解菌。实验4-1降解苯酚微生物的选育五、实验报告1．记录分离得到的苯酚降解菌情况于表4-1。2．根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长曲线。3．记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的菌落特征和镜检特征。实验4-1降解苯酚微生物的选育表4-1苯酚降解菌株的降解率菌源菌株不同酚浓度平板生长状况0.025%0.045%0.060%0.075%菌源菌株苯酚降解率﹤70%71%～80%81%～90%91%～100%返回实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株一、实验目的1．掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理。2．学习筛选、检出和鉴定营养缺陷型突变株的方法。二、实验原理本实验以紫外线作为诱变因素，照射时间为60s，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。再根据营养缺陷型在基本培养基上不能生长，只能在完全培养基或基本培养基中加有它所缺陷的那种物质才能生长的原理，采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，然后用生长谱法将缺陷型加以鉴定。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株三、实验材料1.菌种野生型大肠杆菌（E.coli）。2.培养基肉汤液体培养基，加倍肉汤液体培养基(2E)，固体完全培养基，基本培养基(固体)，无N基本液体培养基，2N基本液体培养基，见附录Ⅲ。3.生长因子类别混合氨基酸和混合维生素的配制（若所用氨基酸为DL型，量需加倍），共分八组（见表4-2）.４.器材培养皿(9cm、6cm)，三角瓶(150mL)，lmL吸管，10mL吸管，离心管(10mL)，带15W紫外灯管照射装置，离心机等。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株表4-2混合氨基酸和混合维生素的配制I赖精甲硫半胱胱嘌II组精苏谷天冬嘧Ⅲ丙甲硫苏羟脯甘丝Ⅳ亮半胱价羟脯异亮缬Ⅴ苯丙胱天冬甘异亮酪Ⅵ色嘌嘧缬酪Ⅶ脯Ⅷ混合维生素（含多种常用维生素）实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株四、实验方法1.诱变处理（1）实验前14～16h挑取野生型大肠杆菌1环于盛有5mL肉汤的三角瓶中，置37℃培养过夜。（2）第2天添加5mL新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，继续培养5h。（3）取5mL培养好的溶液倒入离心管中，离心(3500r/min，10min)。（4）倒去上清液，打匀沉淀，吸入5mL生理盐水，制成菌悬液。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株（5）吸上述菌液3mL于直径为6cm的小培养皿内(皿内放一搅拌子，下为磁力搅拌器)，将培养皿放在15W的紫外光灯下，距离28.5cm。（6）处理前先开紫外灯稳定10min以上，将待处理的培养皿连盖放入灯下灭菌lmin，然后开盖在搅拌条件下处理lmin，照射后盖上皿盖，再关紫外灯。（7）吸3mL加倍肉汤培养液倒入处理后的培养皿中，放置在37℃温箱内，避光培养12h以上。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株2.用青霉素法淘汰野生型（1）吸5mL处理过的菌液于已灭菌的离心管，离心10min(3500r/min)。（2）倒去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，离心洗涤3次，吸生理盐水到原体积。（3）吸取经离心洗涤的菌液0.1mL于5mL无N基本培养液，37℃培养12h。（4）培养12h后，按1∶1加入2N基本培养液5mL，称取青霉素钠盐，使青霉素在菌液中的最终浓度约为500u/mL，再放入37℃温箱中培养。（5）从培养12，16，24h的菌液中，各取0.1mL菌液到预先倒好的基本培养基和完全培养基的平板中涂皿。放入37℃温箱中培养。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株3.缺陷型的检出（1）以上平板培养36～48h后，进行菌落计算，选用完全培养基上长出的菌落数大大超过基本培养的那一组，用无菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个，分别点种于基本与完全培养基平板上，先基本后完全，于37℃温箱培养。（2）培养12h后，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落，在基本培养基的平板上划线复证。37℃温箱培养，24h后不生长的可能是营养缺陷型，便可用于鉴定。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株4.生长谱鉴定（1）将可能是缺陷型的菌落接种于盛有5mL肉汤培养液的离心管中，37℃培养14～16h。（2）培养16h后，以3500r/min离心l0min，倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加生理盐水到原体积。（3）吸取经离心洗涤的菌液lmL于灭菌的培养皿中，然后倒入熔化后冷至40～50℃的基本培养基，摇匀放平，待凝，共做两皿。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株（4）将两只培养皿的皿底，等分8格，依次放入混合氨基酸，混合维生素和核酸碱基混合物，然后放入37℃温箱培养24～28h。整个实验过程参见图4-2。五、实验报告观察生长圈，确定是哪种营养缺陷型。实验4-2利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株图4-2紫外线诱变筛选大肠杆菌营养缺陷型突变株流程图返回实验４-３微生物菌种的保藏方法一、实验目的了解并掌握菌种保藏的常用方法、基本原理及其应用。二、实验原理菌种保藏的原理是微生物在低温、干燥、缺氧的条件下会降低代谢活动，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而能够较长期地保藏菌种，并能推迟细胞退化，降低菌种的变异率。常用的保藏方法包括斜面传代保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法等。这些方法操作简便易行，不需要特殊设备，为一般实验室及生产单位广泛采用。实验４-３微生物菌种的保藏方法三、实验材料1.菌种细菌、放线菌、酵母菌、霉菌斜面菌种。2.培养基牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马丁氏培养基，马铃薯葡萄糖培养基。3.试剂10%HCl，筛子，无水氯化钙，医用液体石蜡（比重0.83～0.89），河沙，瘦黄土（含有机物少的黄土）。4.器材干燥器，40目及100目无菌筛子，无菌试管，无菌移液管（1mL及5mL），接种环，接种针，无菌滴管，超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅。实验４-３微生物菌种的保藏方法四、实验方法1.砂土管保藏法此法仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌或霉菌等。(1)无菌砂土管制备①河砂处理取河砂1000～1500g，用40目筛子过筛，除去大的颗粒。再用10%HCl溶液浸泡，除去有机杂质，盐酸用量应浸没砂面，约浸泡24h，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。用磁铁石除去黄砂中的铁质。②筛土取30cm以下的较贫瘠非耕作层的黄土若干，自来水冲洗至中性，烘干磨细，用100目筛子过筛。实验４-３微生物菌种的保藏方法③砂和土混合砂和土以1∶1或3∶2混合均匀，装入100mm×10mm小试管中。装量约1cm高即可，塞上棉塞，包上牛皮纸。④灭菌高压蒸汽灭菌，121℃灭菌1～1.5h。每天一次，连续灭3d。在50℃以下烘干。⑤无菌检查取灭菌后的砂土少许，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养1～2d，观察有无杂菌生长。如有，则需重新灭菌。实验４-３微生物菌种的保藏方法（2）制备菌悬液首先使斜面菌体生长健壮，孢子饱满，吸取3～5mL无菌水至1支已培养待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下孢子或菌苔（注意不要带入菌丝和培养基），使成菌悬液，细胞浓度为108～1010mL-1。（3）加样用无菌吸管吸取菌悬液，在每支砂土管中滴加4～5滴菌悬液，用接种环拌匀，塞上砂土管棉塞。（4）干燥将已滴加菌悬液的砂土管置于干燥器内。干燥器内应预先放置无水氯化钙用于吸水。当无水氯化钙因吸水变成糊状时则应进行更换。如此数次，砂土管即可干燥。有条件时，也可用真空泵连续抽气约4h，即可达到干燥效果。实验４-３微生物菌种的保藏方法（5）抽样检查从抽干水分的砂土管中，每10支抽取1支进行检查。用接种环取少许砂土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，并进行培养。检查有无杂菌生长及所保藏菌种的生长情况。（6）保藏若经检查没有发现问题，可将砂土管继续放在干燥器内（干燥器底部盛有硅胶、石灰或五氧化二磷等物），用橡皮塞或棉塞塞住试管口，并置于室温或4℃冰箱保存。也可用真空泵抽干水分后火焰封口。实验４-３微生物菌种的保藏方法2.斜面保藏方法（1）贴标签在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期，贴在试管斜面正上方距离试管口2～3cm处。（2）斜面接种将待保藏的菌种用斜面接种法接种在