WHO《人类精液分析》201203-9讲课

一、WHO第五版《人类精液分析实验室手册》新技术、新观点学习二、精子库质控精子库：龙兴宇第一版19801987第三版1992第四版1999第五版2010第二版修订背景以往精液分析存在问题：检测方法不一结果带有主观性、不客观、不真实精确度低、重复性差对男性生育力的评估、临床诊断参考价值很有限因此，需要一个标准化的手册第五版修订的新特点推荐采用称重精液质量推测精液体积的方法使用相差显微镜phase-contrast观察活精子一些重要的精子形态参数的变化增加了关于精子冷冻保存的新章节。一些精液术语（无精症，弱畸精子等）精确定义精子活力的评估。第五版与先前版本的主要不同在于对精子活力的分级。目前推荐精子活力被分为前向运动PR、非前向运动NR的不动精子IM（而不再分为a,b,c和d级）总活力（PR+NP），即前向运动（PR），非前向运动（NP）及非运动精子（IM）需在室温或37℃下计量。第五版本WHO《人类精液检验和处理手册》数据来源、调查方法的特点：1.参考人群进行精确定义，参考值的数据，纳入的参考人群范围广，文献收集更全，多中心，包括前瞻性和回顾性研究，四大洲，14个国家的4500名男性，更具代表性，2.收集了各国新父亲提供的妊娠所需时间（time-to-pregnancy，TTP）的数据3.检测方法尽量采用了标准化方法，具备可比性称重法推测精液体积---计算每次射精总数每次射精精子总数是评价睾丸生精功能和输精管道的通畅情况的重要指标。每次射精精子总数＝精子浓度×体积，精子浓度通过计数板测量，体积则需要通过称重法或者量筒法测量。精液体积WHO第四版推荐使用的是量筒法，即通过将精液倒入有刻度的量筒或者滴管，读取刻度上的体积数。精液体积WHO第五版推荐使用的是称重法，即通过获取精液重量，除以精液密度，从而获得精液体积。然后精子密度×精液体积得到每次射精总的精子数目。精液量:WHO5不推荐的方法——量筒法量筒法为什么?吸取或抽取至量筒会导致:•错误的低体积•-0.4-0.9ml(丢失14%)(Cooperetal.2007)XXX先给洁净的一次性取精杯称重；用取精杯收集精液样本，给盛有精液的取精杯一同称重；总重量减去取精杯的重量；根据公式重量÷精液密度＝体积通常精液密度为1g/ml，精液密度在1.043和1.102g/ml之间(Huggins等,1942;Brazil等,2004a;Cooper等,2007)。每次射精精子总数＝精子浓度×体积（注：由于生产批次的问题，每个取精杯可能具有不同的重量，所以应该提前分别称重。用标记笔在容器上标明其重量。）精液量:WHO5推荐的方法——称重法重量=9.55克-7.92克=1.63克体积=1.63/1=1.63毫升每次射精精子总数=1.63毫升×精子浓度存在问题：每一份精液标本密度都一样吗？相差显微镜优势相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。相差显微镜可能减少光透光度，适当防止活力和形态不准确地测量用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。第四版（a）快速前向运动精子（b）慢速前向运动精子（c）非前向运动精子（d）不运动精子第五版前向PR（a+b）非前向NP（c）不动精子IM（d）精子活力分级新定义新老精液变量的参考值对比：第四版第五版精液体积：2ml1.5ml精子密度：20×106/ml15×106/ml总精子数/次：40×10639×106活动率：A+B50%/A25%PR+NP40%/PR32%形态正常率15%4%存活率：50%58%在旧版标准中，A、B、C、D级分别代表快速前向运动、慢速前向运动、非向前运动、或不动这四类精子。A级精子所占比例在25%以上、或A级和B级精子加起来在50%以上的为正常；而新版标准建议，将A和B级精子被合为同一级别。前向活动精子PR32%总活动力PR+NP40%新拟定的精液常规检验单精子头部判断标准分类WHO第5版WHO第4版正常标准精子头外形上应该光滑、规则，大体上呈椭圆形；长度4.1μm，宽度2.8μm，（95%可信区间为为3.7-4.7；2.5-3.2；），长宽比1.5，（95%可信区间为1.3-1.8），顶体区域必须没有大的空泡，小的空泡不超过2个，空泡的面积不能超过精子头部的20%，顶体后区不能有任何空泡顶体界限清晰，占头部的40%-70%；精子头的形状必须是椭圆的，长度为4.0～5.0μm;宽为2.5～3.5μm；长宽比为1.50～1.75之间；顶体界限清晰，占头部的40%-70%异常标准有空泡的头（超过2个空泡或未染色的空泡区域占头部的20%以上）顶体后区有空泡、顶体过小或顶体过大的头（＜头部的40%或＞头部的70%）有空泡的头（未染色的空泡区域占头部的20%以上）；顶体过小头（＜头部的40%）WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较精子颈和中段判断标准分类WHO第5版WHO第4版正常标准中段应细，规则，大约与头部长度相等，并且主轴与头部长轴一致；长度95%可信限区间为3.3-5.2宽度95%可信限区间为0.5-0.7；中段应细，大约为头部长度的1.5倍，并且在轴线上紧贴头部；宽度＜1μm异常标准缺陷包括：颈部急剧弯曲；中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段以及上述缺陷的任何组合。缺陷包括：颈部“弯曲”（颈和尾形成的角度大于头部长轴的90％）中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段以及上述缺陷的任何组合。WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较精子尾部判断标准分类WHO第5版WHO第4版正常标准主段应是直的，均一的，比中段细，其长约45μm。主段应是直的，均一的，比中段细，非卷曲的，其长约为45μm。异常标准主段缺陷包括：短、多尾、发卡形、断裂主段急剧弯曲、主段宽度不规则、主段卷曲以及上述缺陷的任何组合卷尾（360°）可能提示附睾功能异常主段缺陷包括：短、多尾、发卡形、断裂主段弯曲（＞90度）、主段宽度不规则、主段卷曲以及上述缺陷的任何组合WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较正常形态精子精子头部长度为4.0-5.0um,宽度为2.5-3.5um,长宽之比为1.50-1.75，顶体界限清晰，占头部的40%-70%，中段稍细，宽度1um,约为头部长度的1.5倍，尾部直，均一，比中段细，非卷曲，长度约为45um，形态异常精子1.畸形精子：头部畸形、中段偏厚、双尾2.畸形精子：头部畸形、中段畸形3.畸形精子：梨形头、中段弯曲、不规则、胞浆小滴过多4.畸形精子：头部畸形5.畸形精子：梨形头6.畸形精子：头部畸形19.畸形精子：头部畸形、中段偏厚20.畸形精子：头部畸形、空泡数221.畸形精子：头部正常、顶体70%22.畸形精子：头部畸形、顶体70%23.畸形精子：头部畸形、顶体40%24.畸形精子：头部畸形、顶体40%1.异常精子：头部畸形、胞浆小滴过多2.异常精子：头部正常、中段弯曲、尾部正常3.异常精子：头部异常、顶体70%，尾部弯曲10.畸形精子：头部异常、中段弯曲、非对称性插入、尾部卷曲11.畸形精子：头部正常、中段偏厚、尾部弯曲12.畸形精子：头部正常、中段弯曲、尾部正常无精液症没有精液（不射精或逆行射精）。弱精子症前向运动（PR）的精子的百分率低于参考值下限。PR32%弱畸精子症前向运动（PR）和形态正常的精子的百分率均低于参考值下限。PR32%和形态正常率4%无精子症射出精液中无精子（所提供的评估方法无法检测到样本中精子）。隐匿精子症在新制涂片中无精子，但离心后可见精子。血精症精液中存在红细胞。白细胞精子症精液中含有白细胞高于正常值下限。1.0×106/ml死精子症精液中精子存活比例低，不活动精子百分率高正常精子症精子的总数（或是采取上述方法所报告的密度），前向运动（PR）和正常形态精子的百分率等于或高于参考低值。PR+NP40%/PR32%，形态正常率4%少弱精子症精子的总数（或是采取上述方法所报告的密度）和前向运动（PR）精子的百分率均低于参考低值。密度15×106/ml，PR+NP40%/PR32%少弱畸精子症精子的总数（或是采取上述方法所报告的密度）*，前向运动（PR）和正常形态精子的百分率均低于参考低值。密度15×106/ml，PR+NP40%/PR32%，形态正常率4%少畸精子症精子的总数（或是采取上述方法所报告的密度）*和正常形态精子的百分率均低于参考低值。密度15×106/ml，形态正常率4%少精子症精子的总数低于参考值下限。密度15×106/ml，畸精子症正常形态精子的百分率低于参考低值。形态正常率4%精液术语定义精液分析的质量控制质控基本原理误差：测定值和真值之差。随机误差和系统误差SOP的制定室内质控，室间质控质控品的使用精液分析的常见系统误差①方法误差：②操作误差：③仪器与试剂引起的误差：质控图Xbar图Xbar图的设计主要目的是检测结果偏离靶值的程度。系统误差可以通过连续测量相同样本检测出来。对同一样本重复测量，用均值与时间做图。该程序需要使用已知真值和靶值的储存样本，该储存样本可由厂商（购买样本）、EQC计划提供，或评估值（对样本的多次分析）。S图检查是否由于检测人员造成高度变异的结果Xbar图S图QC图的基本控制原则控制原则误差一个结果超出控制限随机误差3点中的2点超出处置限5点中的4点超出警戒限连续两个结果都超出警戒上限或低于警戒下限系统误差系统误差系统误差连续两个结果,一个高于警戒上限,一个低于警戒下限随机误差连续八个结果均高于或低于均值系统误差失控的原因样本混匀不充分检测人员紧张技术不精培训不充分仪器的问题质控样本变质设备尤其是加样器或计数池的更换操作程序或实验室环境改变对失控处理一旦发现质量控制出现失控，必须按以下程序处理：1.行政处理：（1）立即报告负责人或科主任。（2）当天同项目检测报告不能发出，并向相关技术人员和病人做出解释。•2、技术处理：（1）分析原始数据，；（2）检查质控品，。（3）回顾整个试验操作过程有无失误，包括：标本采集室内温度，湿度，运送，处理，操作过程，仪器故障，电压，以及有无其他干扰因素。（4）重新进行校准，重测失控项目：用新的校准物校准仪器，排除校准失误的原因（5）原因找到后，重新进行质控品测定，如果测定值在控制内，则可进行标本的重新检测，然后发出报告。（6）如果检测结果仍然不稳定，重复性差，质控失控，联系外单位专家精子计数总量与抽样误差关系两次计数均数之差可以接受的差异范围两次计数的总和Differencebetweenduplicatecounts两次计数均数之差可以接受的差异范围:Poisson分布例如,计数200精子,可接受的差异是28，计数400精子,可接受的差异是39，如果39,需再次取样稀释计数(WHO2010)010020030040050060001020304050两次计数百分率之差可以接受的差异范围例如：重复测定400个精子，当平均百分率为20%时，两次之间的差异应该8%，当平均百分率为5%时，差异应5%。如果实际差异超过了此标准，应另外制备2份新鲜样本并重新评估精子活力。平均百分率百分率差异精子库质控每周对新合格进行冷冻实验，保证冷冻效果的平稳每月进行冷冻总结2012-2冷冻复苏率75.70%75.38%74.86%66.20%73.91%0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%长沙湘潭株洲常德岳阳冷冻复苏率总平均冷冻复苏率复苏警戒上线复苏警戒下线复苏控制上线复苏控制下线每月复苏率总结2012-2冻后活率37.85%39.95%37.43%33.10%37.40%0.00%5.00%10.00%15.00%20.00%25.00%30.00%35.00%40.00%45.00%50.0