分子生物技术3(PCR技术)

PCR技术第一节体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物复习5′3′加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。复习PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））1971年，Khorana等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)引物基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段一、PCR技术原理是一种在体外由引物介导的特定DNA序列扩增的酶促反应。通过重复进行的DNA复制过程，获得呈指数增长的DNA拷贝数。每一次DNA的扩增包括3个步骤，即一个循环：变性—退火—延伸DNA形成单链模板—引物与模板结合—DAN聚合酶合成子代DNAPCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火ＰＣＲ原理的动画94℃变性50-65℃退火XX℃延伸TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020PCR的基本条件在微量离心管中进行适量的缓冲液微量的模板DNA四种脱氧单核苷酸耐热性DNA聚合酶一对合成DNA引物PCR的特点高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍由于PCR的产物以指数方式增加，即PCR的扩增倍数Y＝2ｎ（n为循环次数）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶二、PCR反应体系模板制备的思路：在不引入影响PCR反应物质的前提下，裂解细胞让核酸暴露到PCR缓冲液中内。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类模板浓度一般为100ngDNA模板/100L。过高会导致反应的非特异性增加。DNA模板引物对于PCR反应的重要性１.决定了特异性２.决定了扩增片段的长度引物浓度一般为0.1-0.5mol/L。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物１.引物的数量：需要设计一对引物，分别与待扩增的模板正负链3′端互补。２.引物的长度：不宜过长或过短，过长容易形成链内发夹结构，过短则会降低扩增的特异性。３.避免引物二聚体的产生。两条引物间，尤其是3′端的序列不可互补。引物使用浓度：0.1～0.2ummol/l，浓度过高容易生成引物二聚体。引物设计原则（了解）４.引物的碱基组成：引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基的堆积造成错配，G+C含量一般在45％～55％为宜。５.引物的Tm值两条引物的Tm值不能相差太大，引物Tm值的计算公式为：Tm℃＝2（A+T）＋4（C+G）。６.引物的修饰或标记根据需要可在引物的5′端进行修饰，如加入酶切位点，进行标记，引入突变位点，引入启动子等。设计引物最好采用电脑软件进行分析，有助于综合考虑上述各因素。TaqDNA聚合酶耐热DNA聚合酶以Taq聚合酶应用最广泛。Taq酶的耐热性在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为130min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95℃。Taq酶的最适温度是72℃，较高温度下的DNA合成错误率较低。因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR走向自动化。TaqDNA聚合酶有5′→3′外切酶活性，而无3′→5′外切酶活性，无校对活性。因此在PCR中每2╳104个核苷酸中有可能掺入1个错误核苷酸，这对一般的PCR产物分析不会有多少影响，但将PCR扩增产物用于分子克隆时，需使用更准确的DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶有Mg2+依赖性，Mg2+在反应体系中。TaqDNA聚合酶具有末端转移酶活性，优先在产物3′端加上单碱基“A”。dNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。dNTPMg2+是DNA聚合酶的激活剂。使用浓度为0.5mmol/L~2.5mmol/L。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。Mg2+平台效应出现的影响因素模板初始量越多，平台出现越早；引物二聚体形成；反应产物（PPi、反应产物与引物对模板的竞争）的反馈性抑制；反应体系中各组份的消耗；酶活性的降低等。变性使双链DNA解链为单链。94℃；30秒退火温度由引物长度和GC含量决定。Tm－5℃；30秒Tm估算公式：Tm=4×（A+T）+2×（G+C）增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏性。延伸延伸时间由扩增片段长度决定。72℃；30秒~1分钟循环次数主要取决于模版DNA的浓度。一般为25-35次次数过多：扩增效率降低（平台效应），错误掺入率增加三、PCR反应条件——循环参数设置94℃55℃72℃94℃72℃PCR循环30次5min30Sec30Sec30Sec5~7min经典循环参数（扩增片段＜500bp）PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5minPCR基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)注意事项：同时设立对照组（对照组不加模板DNA）四、PCR自动化——DNA扩增仪RCR仪分为三大类，主要通过变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的。各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数水浴式PCR仪变温铝块式变温气流式PCR仪五、PCR产物的检测凝胶电泳检测HLPC固相测定系统SPA(ScintillationProximityAssay)系统点杂交检测系统电化学发光检测系统DNA酶免疫测定系统激光诱导荧光检测法PCR产物电泳结果示意图PCR产物电泳结果能得到什么信息？1.产物分子大小。2.扩增的特异性3.产物大致的浓度固相测定系统（自学）——亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子技术用亲合素包被聚苯乙烯微量滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的PCR产物，进行定量。定量方法:双重标记的扩增产物加至亲合素包被的微量滴定板上温育，洗涤后，与DIG抗体:AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色。可用仪器比色或读数。将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。SPA系统（自学）用亲合素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物，此捕获过程可使与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，此法具有更大的线性范围。电化学发光检测系统（自学）通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2，2'-联吡啶-钌螯合物(TBR)标记的探针杂交，加入三丙胺(tripropylamine，TPA)溶液，并转移至电化学发光仪的检测池，当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，此法的敏感性为amol水平，可自动化测量。DNA酶免疫测定系统（自学）通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。激光诱导荧光检测法（自学）首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。六、PCR质量控制实验室设置不当和实验人员操作不规范是导致结果不准确的主要原因。实验室的规范设置影响质量的因素临床基因扩增实验室设置包括4个区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应区；产物分析区。区域设置的原则：因地制宜、相互独立、单向循环、仪器专用、器材不能换区使用。可在PCR实验区之外进行标本的前处理，如分离血清等。假阳性及防治污染是导致PCR假阳性的主要原因。污染主要来自于：扩增产物的污染（为最主要的来源）、试剂及器材污染、标本间的交叉污染、实验人员的污染等。污染的防治：规范操作、严格管理、设置对照系统（阴性对照、阳性对照、内对照）、试验用器材高压消毒或10％次氯酸钠消毒、清洁实验台面、紫外线照射、减少开盖次数等。假阴性及防治防止抑制酶活性的因素存在充分处理标本暴露DNAPCR的类型第二节目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μm,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究不对称PCR高浓度引物低浓度引物反向PCR(reversePCR)目的：对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。方法：用反向互补引物扩增两引物以外的DNA片段用途：探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶嵌套式PCR（槽式PCR）技术多重PCR(multiplexPCR)目的和方法：在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。用途：主要用于多种病原微生物的同时检测；病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型；突变或缺失存在多个好发部位的检测。注意：引物之间的干扰以及产物片段长度的重叠影响结果的准确性；每对引物应当有相近的Tm值、GC%含量和长度；产物大小能够保证相差大于150bp。引物Ⅰ1引物Ⅰ2引物Ⅱ1引物Ⅱ2引物Ⅲ1引物Ⅲ2DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：病人B中扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用