流式细胞术

•一、流式细胞术的概念流式细胞术（FCM）就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。二、流式细胞仪的工作原理待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包括下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。三、流式细胞仪可检测到的细胞参数1前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。2侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。3荧光强度（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个FL。四、流式细胞术的应用1细胞DNA含量检测：细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。•肿瘤诊断：•DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。肿瘤预后估计：异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和较高的S期百分比都是不良预后的标志。同样的，在肺癌、头预部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤DNA倍体能更客观地预测预后。•凋亡：•由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。检测调亡，可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。•细胞表型的分析得益于单克隆抗体的产生及发展，现在CD系统已有247种之多。细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一般用直标法，也可用间标法。荧光探针多为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。2细胞表型分析：淋巴细胞分类：•CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。造血干/祖细胞计数•造血干/祖细胞存在于骨髓和外周血中，形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法难以识别。由于造血干/祖细胞表面可表达CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45单克隆抗体和核酸染料进行三色荧光标记，FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对临床血液病、恶性肿瘤、基因异常等疾病的造血干/祖细胞移植治疗有十分重要的意义。白血病的免疫分型流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数一般在10000～50000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。细胞系的鉴定•新建细胞系•新建立的细胞系，进行系列的表型分析，以确定此细胞系的表型。•已有细胞系的表型分析•对于已知细胞系，由于多次传代和培养条件的改变，细胞遗传信息可能会发生突变，对其进行表型分析，以检测该细胞系是否有变异。3血小板功能分析与血小板病诊断原理血小板是由骨髓巨核细胞产生的无核细胞，正常静止状态呈两面微凸的圆盘状，平均直径2～3μm。活化的血小板呈不规则形状，表面有大量星状突起，彼此间常发生粘附、聚集。血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥功能的分子基础。•静止与活化血小板膜糖蛋白分子的种类、含量、结构、功能等显著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常导致血小板止血功能的异常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表达又是血小板被活化的特异性分子标志。当血小板表面结合有自身抗体时常导致血小板减少。血小板的上述变化，通过用荧光素标记的单克隆抗体结合流式细胞术，可以敏感、特异、快速的诊断血小板病。•血小板检测指标：•质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、•CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)•颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。•活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物•CD62P—活化后期的表面标志•血小板抗体（PAIgG）。•网织血小板计数：常用染料为TO。应用血小板无力症诊断：CD41/CD61缺失或异常巨大血小板综合征诊断：CD42a/CD42b缺失免疫性血小板减少性紫癜诊断：PAIgG血栓前状态与血栓性疾病诊断：血小板活化异常4红细胞疾病诊断网织红细胞计数与应用•网织红细胞是未完全成熟的红细胞，胞浆中仍残留有不同含量的RNA。RNA含量越高，网织红细胞越幼稚，反之，则接近于成熟红细胞。网织红细胞是反映骨髓红系造血的指针。用荧光染料噻唑橙(ThiazoleOrange，TO)可使活体网织红细胞中RNA染色，用488nm激光激发后发射绿色荧光，FCM分析其荧光强度的大小可测量网织红细胞的数量和RNA含量。主要用于贫血筛查。•睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的诊断•红细胞表面CD59缺失5细胞内蛋白的分析：•细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期分析结合起来，分别分析蛋白阳性和蛋白阴性细胞的细胞周期，这在研究功能蛋白对周期的调控作用是非常有用的工具。6可溶性蛋白的检测：为最新发展起来的用于检测可溶性蛋白的流式细胞技术(CBA)，是将待检蛋白吸附到微球上，再与荧光探针结合，测定微球上这种蛋白的荧光强度，与已知微球的荧光强度相比较，求出待测蛋白的含量，分析软件可自动给出相关方程。7分选：•用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，可用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般分选速度为每少钟300个细胞，而大型机分选速度可达到每秒上万个细胞，并可做到点对点分选。但分选速度也与细胞中目的细胞的百分率及细胞悬液的密度有关。FCM的应用，概括成一句话就是凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进，流式细胞仪的研制、革新，到今天的众多应用领域的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和物理学等学科知识综合运用的结晶。而现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学、药物学等众多研究领域的应用将会越来越广泛。五、流式样品的制备中应注意的几个问题•㈠荧光素和抗体的选择•⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的荧光素，常用的荧光素有：•①测细胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。•②测细胞蛋白、抗体或抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。•③测细胞膜电位：Rho-123。•④测钙离子：Fluo-3。•⒉抗体的选择：•一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。㈡样品的准备•评价一个样品制备的优劣，可有三个评价指标，即①细胞的密度，不能低于1×106/ml；②非特异荧光，不超过1％；③细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的团块。•流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可信，虽然与仪器操作者的水平有很大关系，但在很大程度上取决于样品制备的优劣。细胞密度太低，影响测试速度并造成测试参数调整的困难，尤其是在做DNA分析时，由于细胞太少，势必要提高样品的流速，人为地增大了G0/G1期的CV值，影响了结果的可靠性；非特异荧光强，则造成样品结果的假阳性；聚集体增多，尤其是肉眼可见的细胞聚集体，可造成流式细胞仪进样针的阻塞，影响仪器的性能，碎片可干扰测试结果，造成结果分析的困难。流式样品制备过程中常见的问题及解决对策常见问题原因解决对策细胞密度低制备过程中细胞损失增加离心时间、吸弃上清非特异荧光强抗体不纯、死亡细胞多选择纯度高的抗体、用同型对照抗体或双标记排除非特异荧光碎片多细胞死亡、机械损伤在细胞生长状态良好时测试、避免反复吹打细胞聚集消化不完全、酒精固定造成的细胞粘连彻底消化、在用酒精固定细胞时加入终浓度为1.5-3％的小牛血清荧光弱灵敏度不够、抗体加入量不饱和、反应时间短改用生物素-亲和素、增加抗体用量、延长反应时间测不出亚二倍体峰凋亡测试方法选择不当改用原位末端标记或Annexin-V和PI双标记法㈢样品对照•细胞的荧光有自发荧光、非特异荧光和特异荧光，并且流式细胞术提供的阳性细胞百分比和荧光强度都是相对阴性细胞而言的，所以在样品制备中样品对照的设置至关重要。①在测DNA时，要设正常细胞对照，即不做任何干预的细胞对照。②在检测细胞膜CD分子和细胞内蛋白或细胞因子时，要设同型抗体对照，如果是双标记或三标记检测，还要设单标记的阳性对照。六、流式样品的制备：⒈细胞DNA分析：用本法可测定细胞周期、细胞倍体和凋亡，在样品制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，建议在固定细胞时加入1.5%-3%小牛血清。①培养的细胞系、体液中分离的有核细胞或分离的组织细胞约1×106，离心沉淀后用0.3ml含5%-10%小牛血清的PBS悬浮，移入1.5mlEP管中，加入0.7ml无水乙醇，置-20℃固定细胞24小时以上（用本法制备的细胞可在-20℃保存一周甚至更长的时间）。②3000rpm离心细胞30秒，吸弃上清，用1mlPBS重悬细胞，再离心洗涤细胞一次，吸弃上清，沉淀细胞用100μl1mg/mlRNaseA悬浮，37℃30min以消化RNA，再