流式结果分析JSS

流式结果分析流式原理流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。流式原理流式常用细胞特征细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式常用实验1、细胞凋亡2、细胞周期测定3、膜电位检测4、表面分子测定流式检测细胞凋亡磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。流式检测细胞凋亡常用检测试剂盒：FITC-PI(常见细胞)PE-ADD（绿色荧光的细胞）流式检测细胞凋亡流式检测细胞周期PI为非膜通透性染料，不能染活细胞。在流式染色时通过Triton等的作用，进入细胞与DNA结合而发出荧光，通过检测颗粒中荧光强度测得相对DNA含量，根据细胞在不同周期中DNA含量的不同，将细胞分为不同的周期。破膜的方法：1、triton打孔2、70%乙醇固定3、低渗法（比较简单）流式检测细胞周期表面标志物、蛋白等将所要检测的蛋白用带有荧光标记的一抗孵育后，蛋白就会带上相应的荧光，之后用流式检测荧光值，便可得到表达情况表面标志物——以CD44为例线粒体膜电位的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如DiOC6、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。JC-1检测原理JC-1有单体和多聚体两种存在状态，低浓度时，以单体存在，可检测到绿色荧光，用流式检测时，通常为FL-1通道(和FITC同通道）高浓度时，以多聚体存在，可检测到红光，流式检测通常为FL-2通道（和PE同通道)。因JC-1浓度的变化,在单体和多聚体之间形成一个可逆的转变过程。正常细胞，膜电位正常时，JC-1通过线粒体膜极性进入线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过检测绿色和红色荧光来定性(细胞群的偏移）定量（细胞群的荧光强度）的检测线粒体膜电位的变化流式原理流式原理Thankyou！