第十章 新酶的发现与筛选

酶工程第十章新酶的发现与筛选一、新酶的来源酶筛选的任务：寻找包含所需酶活性的微生物菌株，或编码所需酶的基因，以实现特定的生化反应。2020/2/282第10章新酶的发现与筛选酶的来源：①动物细胞、组织液或分泌物；②植物细胞、组织液或分泌物；③微生物细胞（主要，80%以上）微生物作为酶源的优点（1）种类繁多、分布广微生物“无孔不入，随遇而安”微生物具有多样性①物种多样性：据估计总类别在50万至600万之间②生理代谢类型多样性：有机物和有毒物质分解、转化③遗传基因多样性：已完成测序细菌1214种、古细菌93种、真菌17种（2010年数据）2020/2/283第10章新酶的发现与筛选微生物作为酶源的优点（2）培养简便、繁殖快、发酵周期短，能控制培养条件大幅度提高酶的产量。（3）微生物易变异，可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想的菌株。2020/2/284第10章新酶的发现与筛选二、微生物新酶的获取途径2020/2/285第10章新酶的发现与筛选获取途径购买商品化的酶购买产酶微生物从自然界筛选产酶微生物从基因克隆库中筛选酶基因1、购买商品化的酶向酶制剂供应商购买商品化的酶世界主要酶制剂供应商：Sigma、NovoNordisk、ThermoGen、RocheMolecularBiochemicals等2020/2/286第10章新酶的发现与筛选特点：方便易得，可大量供应种类少、成本高、知识产权问题2、购买产酶微生物从菌种保藏库购买酶来源微生物国内外主要菌种保藏机构：ATCC、DSMZ、CCTCC、CICC、CGMCC2020/2/287第10章新酶的发现与筛选特点：方便易得，成本较低（600-800元/株）需要进一步筛选3、从自然界筛选产酶微生物从土壤、水体中筛选产酶微生物广泛采用，盲目，工作量大2020/2/288第10章新酶的发现与筛选3、从自然界筛选产酶微生物从基因克隆库筛选2020/2/289第10章新酶的发现与筛选克隆库构建方法：基因组狩猎基因挖掘宏基因组筛选三、新酶筛选的策略新酶筛选的一般规律（原则）2020/2/2810第10章新酶的发现与筛选筛选前回答三个问题明确反应目标：筛选什么酶？在合适的微生物群体中筛选：从哪里筛？确立高效筛选方法：用什么样的筛选方法？三、新酶筛选的策略1、筛选什么样的酶2020/2/2811第10章新酶的发现与筛选根据需要实现的化学反应，选择所需酶的类型了解化学反应对于酶性质的要求，比如对温度、pH、盐浓度等的耐受力等三、新酶筛选的策略2、从哪里筛2020/2/2812第10章新酶的发现与筛选主要筛选对象：水体和土壤采集场所：淀粉酶产生菌：面粉厂周围纤维素酶产生菌：腐败树叶层下脂肪酶产生菌：油脂厂附近蛋白酶产生菌：蚕丝、豆饼等腐败变质的地方嗜极微生物：火山口、盐碱地、深海、极地冰层下等三、新酶筛选的策略3、筛选方法（1）分级筛选法2020/2/2813第10章新酶的发现与筛选初筛：迅速定性或粗略定量鉴别，除去大多数不符合要求的菌种或酶。平板筛选法、多孔板法等复筛：精确测定酶活，筛选出需要的酶或产酶微生物。常采用HPLC或GC三、新酶筛选的策略3、筛选方法（2）高通量筛选法2020/2/2814第10章新酶的发现与筛选方法：多孔板培养微生物，并用酶标仪进行光谱分析。原理：反应产物具有吸收峰值，发光或产生荧光。四、从自然界筛选产酶微生物2020/2/2815第10章新酶的发现与筛选调查研究查阅资料采样富集培养纯种斜面分离纯化筛选初筛、复筛优质菌株性能鉴定生产性能、毒性、菌种鉴定生产应用诱变育种筛选流程四、从自然界筛选产酶微生物1、样品采集2020/2/2816第10章新酶的发现与筛选方法：根据所要实现的化学反应确定需要的酶及产酶微生物的类型，选择采样环境土样采集方法：除去表层土，取离地面5~15cm处的土样，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中，扎紧，标明时间、地点、天气和周围环境等信息。四、从自然界筛选产酶微生物2、富集培养2020/2/2817第10章新酶的发现与筛选目的：使目的菌株大量繁殖，成为优势菌株原理：根据微生物的特点，“投其所好”或“取其所抗”，在培养基中投放或添加特殊养分或抗菌物质，使天然环境中劣势菌转变为人工环境中的优势菌。富集培养方法（1）控制培养基的营养成分2020/2/2818第10章新酶的发现与筛选在培养基中加入一定量底物，筛选生长优势菌株加入底物作为唯一碳源或氮源逐步提高底物添加浓度，连续富集培养用不同的培养基筛选不同类型的微生物细菌：牛肉膏蛋白胨培养基放线菌：高氏一号培养基霉菌：察氏培养基酵母：豆芽汁培养基富集培养方法（2）控制培养条件2020/2/2819第10章新酶的发现与筛选控制培养pH、温度及盐浓度等细菌、放线菌（pH7.0~7.5）霉菌、酵母菌（pH4.5~6.0）筛选嗜热微生物：高温筛选嗜盐微生物：NaCl15%~20%富集培养方法（3）抑制不需要的菌类2020/2/2820第10章新酶的发现与筛选通过高温、高压或加入抗生素等抑制剂减少非目的微生物的数量高温处理（80℃）筛选芽孢菌抑制细菌：加入青霉素（G+）、链霉素（G-）、四环素、金霉素、孟加拉红等抑制放线菌：青霉素、卡那霉素，安普霉素，壮观霉素等抑制真菌：纳他霉素、井冈霉素或者制霉菌素，或者两性霉素等富集培养方法（4）稀释培养法2020/2/2821第10章新酶的发现与筛选长期生长在营养贫乏的环境中的微生物对过高浓度的有机质敏感，生长受到抑制，可用稀释后的培养基进行富集培养。四、从自然界筛选产酶微生物3、菌株分离纯化2020/2/2822第10章新酶的发现与筛选富集培养获得具有生长优势的菌株，但其他菌株依然存在，需要用合适的方法加以分离分离纯化方法：稀释涂布或划线分离四、从自然界筛选产酶微生物4、初筛2020/2/2823第10章新酶的发现与筛选平板筛选法薄层层析法高通量筛选法1、平板筛选法（1）变色圈法2020/2/2824第10章新酶的发现与筛选将指示剂掺入固体培养基中进行待选菌悬液的单菌落培养，或将指示剂喷洒在平板单菌落表面，指示剂与底物或产物反应，在菌落周围形成变色圈。淀粉酶：淀粉（底物）+碘液（指示剂）氨基酰化酶：N-乙酰氨基酸（底物）+溴甲酚紫（指示剂）溴甲酚紫，pH6.2显紫色；pH4.8显黄色1、平板筛选法（2）透明圈法2020/2/2825第10章新酶的发现与筛选在固体培养基中掺入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景，在产特定酶菌种菌落周围会形成透明圈。淀粉→淀粉酶几丁质→几丁质酶酪素→蛋白酶吐温→脂肪酶纤维素粉→纤维素酶α-葡聚糖酶→1,3-α-葡聚糖2、薄层层析法（TLC）薄层层析2020/2/2826第10章新酶的发现与筛选混合样品由于样本被点在薄片后，展开剂会因为毛细现象而向上移动。不同的分析物因为极性差异会以不同的速度向TLC片上端爬升，因而达到分离目的。3、高通量筛选法高通量筛选法的概念2020/2/2827第10章新酶的发现与筛选以分子水平或细胞水平的实验方法为基础，以多孔板形式为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对成百上千的样品进行检测分析。特点：准确、微量、灵敏、快速和廉价2020/2/28生物化学第6章生物氧化28高通量筛选采用的设备2020/2/2829第10章新酶的发现与筛选96孔板384孔板1536孔板深孔培养板多通道移液器酶标仪高通量筛选采用的设备2020/2/2830第10章新酶的发现与筛选3、高通量筛选法基于颜色变化的高通量筛选反应生成有颜色的产物或有色的底物经反应后生成无色的产物，或底物/产物与其他物质反应生成有色络合物2020/2/2831第10章新酶的发现与筛选2,4-二硝基苯肼筛选还原酶3、高通量筛选法基于颜色变化的高通量筛选2020/2/2832第10章新酶的发现与筛选对硝基苯酚醚筛选水解酶对硝基苯酚醚（无色）酚盐（黄色）2020/2/28333、高通量筛选法基于荧光发生的高通量筛选采用荧光底物，经酶水解后释放荧光基团，用高通量荧光计测定2020/2/2834第10章新酶的发现与筛选伞形酮（无色）伞形酮阴离子（蓝色荧光）伞形酮筛选水解酶，如脂肪酶，磷酸酶，糖苷酶等3、高通量筛选法基于荧光发生的高通量筛选不发荧光的试卤灵前体物质经过催化后,生成了发荧光的试卤灵2020/2/2835第10章新酶的发现与筛选试卤灵筛选酯酶3-苯基丁酸试卤灵试卤灵（荧光）四、从自然界筛选产酶微生物5、复筛2020/2/2836第10章新酶的发现与筛选精确测定菌株产酶能力和催化活力，确认符合生产要求的菌株。方法：HPLC、GC等四、从自然界筛选产酶微生物6、高产菌株选育2020/2/2837第10章新酶的发现与筛选通过筛选得到的菌株如达不到生产要求，还需要进行改良，然后重复筛选工作。菌株选育方法：自然选育诱变育种杂交育种外源基因转化或转导原生质体融合五、从数据库中直接筛选酶基因数据库筛选酶基因2020/2/2838第10章新酶的发现与筛选从数据库中挖掘所需功能的酶是一种更直接、有效且非常有前景的筛选方法基因组狩猎法基因挖掘法NCBI数据库2020/2/2839第10章新酶的发现与筛选NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)美国国立生物技术信息中心网址：、基因组狩猎法基因组狩猎原理2020/2/2840第10章新酶的发现与筛选对某一已经测序的微生物进行全基因组搜索和分析，从而获得候选酶基因。主要包括以下步骤：①分析全基因组序列，获得还原酶基因序列；②克隆所有基因并表达，构建酶表达库；③筛选所需要的酶。1、基因组狩猎法基因组数据2020/2/2841第10章新酶的发现与筛选截至2012年8月，基因数据库(Genbank)已经有超过1亿3900万个核酸序列，它们来自488266个物种的基因组，其中包括3450个完成测序的微生物基因组。示例1基因组序列搜索查找基因组序列：Kluyveromyceslactis搜索基因组序列中的还原酶reductase2020/2/2842第10章新酶的发现与筛选2、基因挖掘法基因组狩猎原理2020/2/2843第10章新酶的发现与筛选以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比对，获得中等相似度（50%~70%）的酶进行克隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。2020/2/2844示例2数据库比对寻找相似酶序列酶探针的氨基酸序列2020/2/2845第10章新酶的发现与筛选NADPH-dependentalpha-ketoamidereductase[Kluyveromycesmarxianus]GenBank:BAP73216.11MTNQKFFTLSNGNKIPAVAVVGTGTKWYKAEETDATFSQELTDIVKLSLDTVPGIVHIDA61AETYKTYPELGAALKETKKPREEIFITDKFSSLHKISEDPKSALETALKKLGVDYVDLYL121IHSPFFDKDLNIDLETAWKQLEELYKSGKAKNIGVSNFTVEDLKKVLAIAEIKPQVNQIE181FSPFLQNQTPGIVEFSQKNDILLEAYSPLGPLQKKPADADQQPFYQYLKELSEKYNKTEA241QVLLLWVYKRGILPVTTSAKIERIKQAQDIFSFDLTEEEVKKITDLGLQHEPVRLYWVDF301YTKYNSEAQK六、宏基因组筛选宏基因组2020/2/2846第10章新酶的发现与筛选宏基因组是特定小生境中全部遗传物质的总称。通过宏基因组提取可以获得实验室条件下不能纯培养微生物的基因序列，大大提高微生物资源的利