凝集反应-ELISA

1免疫学实验课贵阳医学院免疫学教研室21、试管凝集反应（示教）2、ABO血型鉴定--玻片凝集反应（1份/1人）3、类风湿因子检测--乳胶凝集实验（示教）4、乙型肝炎病毒表面抗体检测--ELISA法(1份/1人）实验内容3实验二凝集反应（Agglutination）4实验原理颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体，或可溶性抗原/抗体吸附于与免疫无关的载体，形成致敏颗粒，与相应抗体/抗原在一定的条件下，形成肉眼可见凝集小块的反应，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）。5凝集反应类型直接凝集反应（directagglutination）颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应。间接凝集反应（indirectagglutination）将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的载体颗粒表面，使此颗粒致敏（免疫球），然后再与相应抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。67操作步骤于试管架上列7支试管。1.每管内分别加入生理盐水0.5ml。2.血清稀释：第一管加入1:10待检血清0.5ml，混匀后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第6管，混匀后从第6管中吸出0.5ml弃去；第7管为对照管。0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml（一）试管凝集反应83.每管加伤寒杆菌“H”抗原0.5ml。4.混匀，置52℃水浴4h，取出后，置室温过夜，次日读取凝集效价。9结果观察不同程度的凝集现象：＋＋＋＋：液体澄清，细菌全部凝集（100%），沉于管底形成大片凝集物。＋＋＋：液体基本澄清，细菌大部分凝集（75%左右），管底的凝集物稍小。＋＋：液体半澄清，稍显浑浊（凝集物50%左右），但仍可见明显凝集块。－：液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌呈絮状浮起。10效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高血清稀释度，又称滴度。凝集效价：凝集反应时，能使50%或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度。11（二）玻片凝集反应已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上，在一定的条件下，若两者相对应，则会发生凝集。本方法主要用于抗原的定性分析，如菌种鉴定、ABO血型鉴定等。ABO血型系统2020/2/281213ABO血型鉴定步骤红细胞悬液的制备（用于血型鉴定及ELISA实验）1.取EP管1支分装适量生理盐水2.消毒耳垂或手指皮肤3.用采血针采1-2滴血，加入盛有生理盐水的EP管中混匀（待测抗原）取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张，分别加入待测抗原各1滴，并用牙签混匀。置室温5分钟左右观察结果。1415注意事项用牙签研磨时，注意防止将抗A血清带到抗B血清中，反之亦然。如果凝集现象不太明显时，可用显微镜观察。16类风湿因子（RF）的检测RF是抗人变性IgG的IgM类抗体，将变性IgG包被于乳胶颗粒上，此致敏乳胶颗粒与待测血清结合时，如血清中存在RF，即可出现凝集小块。（三）乳胶凝集试验17操作步骤1.在凝集反应板中取4孔分别加入阴性血清、阳性血清、生理盐水、待检血清各1滴2.每孔分别加入致敏胶乳1滴，充分混匀，置室温５-10分钟观察结果。18免疫标记技术将已知抗体或抗原标记上易示踪物质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等），通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或抗体。19实验五酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbsentAssay,ELISA）【原理】利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。20直接ELISA：包被(未知抗原）加入酶标抗体洗板加底物加终止液21间接ELISA：包被(已知抗原）加入待检标本（未知抗体）加入酶标第二抗体﹙抗抗体﹚洗板加底物加终止液间接ELISA原理23双抗体夹心法ELISA：加入待检标本（未知抗原）加入酶标抗体洗板加底物加终止液包被(已知抗体）双抗体夹心法ELISA原理25乙型肝炎病毒表面抗体的检测——间接ELISA法【测定原理】采用纯化HBsAg包被反应板，加入待检标本，当标本中存在抗-HBs时，该抗体与包被HBsAg结合，再加入酶标羊抗人IgG抗体。最后形成HBsAg-抗HBs-酶标抗抗体复合物，加入底物产生显色反应。26无菌采血，离心2000rpm,3min，取上清作为待测标本每孔加入酶结合物1滴，37℃孵育30min反应板中加入待测标本，同时设阴性、阳性、空白对照孔(NS)（反应板已用纯化HBsAg包被）手工洗板，弃液拍干，重复5次每孔加入显色剂A液、B液各1滴，置37℃孵育15分钟每孔加入终止液1滴，混匀目测法：与阳性和阴性对照比较，观察颜色深浅判断结果【步骤】2020/2/2827