细胞与分子免疫学 2研究生免疫球蛋白

免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因基因工程抗体南京医科大学微生物学与免疫学系卢春概述1、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)：1968和1972年WHO和国际免疫学会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。2、抗体(antibody,Ab)：B淋巴细胞在有效的抗原刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体。3、Ig与Ab的区别和联系：Ig是化学结构上的概念；Ab是生物学功能上的概念；所有的Ab都属于Ig；并非所有的Ig都具有Ab的活性。免疫球蛋白的基本结构1、Ig的组成：由4条肽链通过链间S-S双硫键连接而成，其中两条分子量较大的链称重链（Heavychain，H链），两条分子量较小链的称轻链（Lightchain，L链）。2、H链：据氨基酸（aa）组成及序列的差异（抗原性）将H链分为5类，、、、、链；其分别对应于，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM五类Ig。第一节免疫球蛋白的结构和功能CH1VLCLVHCH2CH3HingeRegionCarbohydrateDisulfidebondImmunoglobulinStructure3、L链：据aa组成及序列的差异将L链分为2型，、型，：为2：1（人）。天然Ig单体中，两条重链是同类的，两条轻链是同型的。4、Ig的分区：（1）可变区：在Ig近N端L链的1/2和H链的1/4（、、）或1/5（、）范围内，因aa组成及序列变化较大，故称可变区（Variableregion，V区）。（2）恒定区：在Ig近C端L链的1/2和H链的3/4（、、）或4/5（、）范围内，因aa组成及序列变化相对稳定故称恒定区（Constantregion，C区）。CH1VLCLVHCH2CH3HingeRegionCarbohydrateDisulfidebondImmunoglobulinStructure5、Ig的结构域又称功能区(Domain)：（1）VH、VL：超变区（HVR1、2、3）、互补性决定区（CDR1、CDR2、CDR3），又称Ig独特型决定簇（Idiotype）;（2）CH1、CL：是各类、亚类、型、亚型Ig遗传标记所在部位;（3）IgG的CH2：补体C1q的结合位点；IgG借助CH2通过胎盘，发挥被动免疫作用；（4）CH3：IgG的CH3与中性粒、巨噬细胞表面表达的FcR结合，完成免疫调理作用；与NK细胞表面表达的FcRIII结合，完成ADCC作用；（5）IgE的CH4：IgE的CH4与肥大和嗜碱性粒细胞表面表达的FcR结合，完成I型超敏反应；（6）绞链区（Hingeregion）：TYCH1VLCLVHCH2CH3HingeRegionCarbohydrateDisulfidebondImmunoglobulinStructure•Fab（Fragmentofantigen-binding）–Agbinding–Valence=1–SpecificitydeterminedbyVHandVLPapainFcFab•Fc（Crystalizablefragment）–Effectorfunctions6、Ig的水解片段(木瓜蛋白酶)•F(ab’)2•Agbinding•Valence=2•pFc’•NoeffectorfunctionsPepsinpFc’PeptidesF(ab’)26、Ig的水解片段(胃蛋白酶)7、Ig的其他成分（1）J链：（joiningchain）由浆细胞合成，功能是将单体Ig分子连接为多聚体。如2个IgA单体形成二聚体；5个IgM单体是形成五聚体。7、Ig的其他成分（2）分泌片：（secretorypiece,SP）由黏膜上皮细胞合成和分泌，功能是保护分泌型IgA或的IgM铰链区免受蛋白酶的降解。五类Ig的特点Ig的生物学活性1、特异性结合抗原2、激活补体3、与细胞Fc受体结合发挥生物效应（1）免疫调理作用（2）ADCC（3）介导I型超敏反应（4）人IgG的Fc段与SPA结合4、选择性传递Ab的生物学活性第二节免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性概述人类B淋巴细胞存在三个编码Ig的基因库，即重链H基因库及轻链、基因库，它们分别位于第14、2及22号染色体上。一、胚系B细胞中Ig轻链基因的结构由3个基因所编码：V基因、J基因编码可变区；C基因编码恒定区，即V----J----C。（一）链基因结构1、Vκ：Vκ基因节段有90个，呈簇状串联排列（Vκ1—Vκn，n=90），其中含30个假基因（指无功能性表达或只表达无功能产物的缺陷基因，但它可通过突变、置换及重排形成新的功能性基因，为可变区的多样性提供后备基因）。Vκ编码V区110aa中的1~96aa；2、L序列：每个Vκ前都有一个L序列（Leader），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；3、Jκ：位于Vκ下游，也呈串联排列，含5个基因节段，编码V区110aa中的97—110aa；4、Cκ：只含单个外显子，编码C区蛋白。（二）链基因结构1、Vλ：Vλ基因节段有60个，呈簇状串联排列（Vλ1—Vλn，n=60），其中含30个假基因；2、L序列：每个Vλ前都有一个L序列（Leader），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；3、Jλ1—Cλ1，Jλ2—Cλ2~~~Jλ7—Cλ7：Cλ1~~~Cλ7代表各个亚型λ链的基因节段，其中含4个功能基因节段和3个假基因。二、胚系B细胞中Ig重链基因的结构由四个基因所编码：V基因、D基因、J基因编码可变区；C基因编码恒定区，即V--D--J--C。（一）重链V区基因1、VH：VH基因节段有95个，成簇状串联排列（VH1—VHn，n=95），其中含45个假基因。每个VH前都有一个L序列（Leader），其作用是在合成重链时将重链固定在粗面内质网膜上。Ln—VHn编码疏水前导肽和CDR1及CDR2；CDH(1-23)2、DH，JH：DH有23个节段，成簇状串联排列；JH有9个节段，其中6个功能基因和3个伪基因。DH—JH编码CDR3，JH编码可变区的骨架部分（Frameworkregion）。CDH(1-23)（二）重链C区基因1、CH：CH基因节段在染色体上的排列顺序与其编码的Ig在体内成熟的顺序相似，分别是Cμ—C—Cγ3—Cγ1—Cα1—Cγ2—Cγ4—Cε—Cα2。除C以外，其他CH基因节段都有一个转换区（Switchregion，S区），其作用是控制Ig类型转换；CDH(1-23)2、控制膜结合或分泌型Ig的基因：每个CH基因节段后分别排列着S和M两基因，S即分泌型，M即膜结合型，如Cμ—Sμ—Mμ、C—S—M。CDH(1-23)三、B细胞分化过程中的基因重排1、基因重排定义：在B细胞分化和发育过程中，一部分基因节段互相接近、重新排列，形成功能性的免疫球蛋白基因单位，此过程称基因重排（GeneRearrangement）。功能性的免疫球蛋白基因单位进行转录，经转录后的加工，再表达为免疫球蛋白。2、可变区的基因重排：（1）重链可变区的基因重排：选择一个DH与一个JH节段连接（DH—JH），再选择一个VH与DH—JH相连，一旦VH—DH—JH重排成功且得到功能性表达，其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排，此现象称为等位基因排除。其产物同时启动轻链可变区的基因重排；CDH(1-23)（2）轻链可变区的基因重排：κ链基因优于λ链基因重排。选择一个Vκ与一个Jκ节段连接Vκ—Jκ，其产物就会发生等位基因排除，同时也会抑制λ链基因重排，称为同型排除。当两条染色体上的κ链基因重排都失败时，才会启动λ链基因重排。两条染色体上的VH基因都是无产物重排，或κ基因和λ基因都是无产物重排，细胞凋亡（Apoptosis）。（3）可变区的基因重排12~23规律和重组酶的作用：可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列（RSS）控制，遵循12~23规律且与DNA损伤修复系统有关。（4）重链类型转换：每个CH（Cσ除外）前都含一个S区（短的串联重复序列），S区与重链类型转换有关。在B细胞分化过程中，V-D-J的重排及其与C的连接是不依赖抗原刺激，重排的V-D-J与Cμ和Cσ连接，经转录加工，此时在B细胞表面表达mIgM和/或mIgD。成熟的B细胞在抗原刺激下，B细胞在分泌IgM和/或IgD的同时，V-D-J从与Cμ基因连接转换到与Cγ或Cα或Cε的连接，完成了类型转换。CDH(1-23)2、Ig的多样性：（1）组合性连接：重链的V-D-J连接（95个V基因、23个D基因，9个J基因）；轻链的V-J-C（90个Vκ基因、5个Jκ基因、一个Cκ基因；60个Vλ基因、7个Jλ基因和Cλ基因）；（2）接合多样性：发生在D-J、V-D-J、V-J连接时，1密码子错位；2框架（ORF）移位；3N-序列插入；（3）体细胞突变：体细胞突变也可以产生Ig的多样性。3、重排过程第三节基因工程抗体（GeneticEngineeringAntibody）概述单克隆抗体(McAb)在临床疾病诊断和治疗中已发挥了很大的作用，但以下几点限制了抗体的导向治疗：（1）鼠源性McAb在人体内易诱导免疫应答；（2）人的McAb制备甚为困难。一、嵌合抗体（ChimericAntibody）原理：保留鼠Ig可变区部分，将其恒定区用人Ig取代。方法：PCR克隆鼠可变区基因和人恒定区基因，将两基因连接，并插入原核或真核表达载体中，并导入大肠杆菌或转染真核细胞，就可表达出嵌合抗体分子。优点：亲和力保持良好。缺点：含鼠Ig可变区的异源性，仍易诱导人免疫应答。原理：仅保留鼠Ig可变区CDR部分，将Ig其它区域都用人Ig取代。方法：CDR序列的获得通常采用PCR技术。优点：大大降低了鼠抗体的免疫原性。缺点：亲和力不佳。二、CDR移植抗体（CDRGraftingAntibody）又称重构抗体或改形抗体（ReshapedAntibody）原理：将鼠IgFv中的VH和VL两肽链用不同的连接物连接成一条多肽链，称为单链抗体（ScFv）；将两个相同或不同特异性的ScFv连接在一个分子上，就获得了双价ScFv。方法：DNA重组技术；共价或非共价交连。优点：亲和力保持良好，可针对2个不同的抗原表位。缺点：容易解离或被组织酶解。三、单链抗体（ScFv）和双价ScFv原理：将鼠IgFab基因片段与丝状噬菌体FUSE5载体连接，产物转化大肠杆菌，使Fab与噬菌体外壳蛋白基因III以融合蛋白表达的形式表达在丝状噬菌体表面，构建成噬菌体表面肽库（Phagepeptidelibrarydisplay）；再用特异性抗原对该肽库进行筛选，获得具有高度抗原亲和力的Fab，最后进行体外重建。方法：DNA重组技术；ELISA。优点：亲和力保持良好。缺点：容易解离或被组织酶解。四、噬菌体肽库技术构建抗体片段Thanks!