HE、Masson、VG、pas、免疫组化、TUNEL染色步骤

石蜡切片的制作包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。一．石蜡包埋法石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下：1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。二．石蜡包埋的注意事项1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤石蜡切片的制作●取材和固定：处死动物后立即切取组织块，并快速投入固定液中。●脱水和透明：８０％酒精（min）９５％酒精Ⅰ（min）９５％酒精Ⅱ（min）无水酒精Ⅰ（min）无水酒精Ⅱ（min）二甲苯Ⅰ、Ⅱ（min）2mm45-6045-6045-6015-302-4mm60-12060-12060-120304-5mm120-240120-240120-24060注意事项：1.脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。2.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。3.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。4.如需过夜，应停留在70%酒精中。5.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。●浸蜡和包埋：浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。包埋：1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。●切片制作：注意事项：1.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。2.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45℃左右）。待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。3.切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。●贴片：待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起。HE染色一、HE染液的配制：（一）Harris苏木素：苏木素精1g一氧化汞0.5g硫酸铝钾20g量取无水乙醇10ml蒸馏水200ml苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。（二）0.5%伊红(水溶性)：伊红0.5g95%乙醇25ml蒸馏水75ml先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。（三）1%盐酸酒精溶液：盐酸1ml酒精99ml混匀，白色试剂瓶保存。（四）中性树胶封片剂：往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。试剂:二甲苯1瓶Harris苏木素染液无水乙醇2瓶1%盐酸水溶液95%乙醇2瓶0.5%伊红(水溶性)染液HE染色二、染色步骤1、80度烤片1小时；2、二甲苯中脱蜡10分钟×3次，用吸水纸吸干液体；3、100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；4、95%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；；5、流水2分钟，用吸水纸吸干水分；6、Harris苏木素染色5分钟；7、自来水稍洗；8、1%盐酸酒精溶液分化5~10秒（切片由蓝变红）；9、自来水洗返蓝25分钟；10、0.5%伊红(水溶性)染色2分11、95%乙醇脱水5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；12、100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；13、二甲苯中透明5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。三、注意事项1、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。2、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。3、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。4、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。Masson染色Masson三色法（根据Masson,1929）一、试剂配制（一）Weigert氏铁苏木素液（可用Herris苏木素代替）甲液：苏木素1g无水酒精（或95％酒精）100ml乙液：29％三氯化铁水溶液4ml蒸馏水95ml（30%三氯化铁溶液则为100ml）盐酸1ml临用时，取甲、乙液等量混合即可应用。混合时应将乙液加人甲液内，染液呈紫黑色。铁苏木素不能象明矾苏木素一样配制后可放置贮存备用，因铁与染色剂的色素根会化合生成不溶性沉淀，所以铁作媒染液时，必须与染液分别配制和分别保存，染片时临时混合应用。由于这是一种铁苏木素，它将胞核染成黑色。能抵抗在对比染色液中所含分色剂的脱色作用，且不会被光线退色，因此比钾矾苏木素染色较为持久。（二）丽春红酸性品红液丽春红（Ponceau2R）0.7g酸性品红（acidfuchsin）0.3g蒸馏水99ml冰醋酸(glacialaceticacid)1ml（三）1%磷钼酸水溶液磷钼酸（phosphomolybdicacid）1g蒸馏水加至100ml（四）2%苯胺蓝液苯胺蓝（anilineblue）2g冰醋酸（glacialaceticacid）2ml蒸馏水加至100ml（五）亮绿液亮绿（lightgreen）1g蒸馏水99ml冰醋酸（glacialaceticacid）1ml（六）Bouin氏液苦味酸饱和液（1.22％）75ml福尔马林25ml冰醋酸5ml此液一般在临用时配制，对皮肤及肌腱有软化作用。Masson染色二、操作方法1．组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋。2．切片脱蜡至水：（1）二甲苯中脱蜡10分钟×3次，用吸水纸吸干液体；（2）100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；（3）95%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；；（4）流水2分钟，用吸水纸吸干水分；3．Weiger氏铁苏木素染5-10分钟。4．流水稍洗。5．1%盐酸酒精分化。1min6．流水冲洗数分钟。25min7．丽春红酸性品红液染5-10分钟。7min8．蒸馏水稍冲洗。9．1%磷钼酸水溶液处理约5分钟。10．不用水洗，直接用苯胺蓝液或绿液复染5分钟。11．1%冰醋酸处理1分钟。上下提动12．95%乙醇脱水3分钟，两次；13．95%乙醇脱水5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；14．100%乙醇5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；15．二甲苯中透明5分钟×2次，用吸水纸吸干液体；结果：胶原纤维呈蓝色(用苯胶蓝液复染)或绿色(用亮绿复染)。胞质、肌纤维和红细胞红色。胞核蓝褐色。注意事项:1、组织用Bouin氏液或Zenker氏液固定为佳。如已用10%甲酸液固定,切片可在脱蜡至水后.再放入Bouin氏液作用一晚或置37℃温箱内1-2小时,然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色。2、铁苏木素染核(见苦味酸一酸性品红法)。3、如没有丽春红染料,可把酸性品红加至1克来配制。4、用1%磷钼酸处理时可在镜下控制.见肌纤维呈红色,胶原纤维呈淡红色即可。VG染色VanGieson氏法染色原理:上面介绍的胶原纤维染色如苦味酸-酸性品红法和三色染色法,都是利用两种或三种阴离子染料混合一起或先后作用而完成鉴别染色的。VanGieson氏染色中,为什么胶原纤维呈红色(被酸性品红所染),肌纤维呈黄色(被苦味酸所染).而Masson氏染色时胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染),肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染),这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。组织的渗透性(Permeability),取决于组织的结构密度。如果细致地观察,会发现组织和细胞成分都是多孔的构造。不同的组织和细胞成分,它们的孔隙大小是不同的。孔隙的大小,决定了组织的渗透性。如孔隙小,组织结构致密,渗透性低；孔隙宽,组织结构疏松,渗透性高。如已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色,则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染.肌纤维与胞质被中等大小的阴离子染料着染,而胶原纤维则被大分子的阴离子染料着染。由此说明了红细胞对阴离子染料的渗透性最小,肌纤维与胞质次之,而胶原纤维具有最大的渗透性。根据组织不同的渗透性能,选择分子大小不同的阴离子染料进行染色,便可把不同组织成分显示出来.染料分子的大小,主要由其分子量来体现。小分子量者易于穿透结构致密、渗透性低的组织,而大分子最者则只能进入结构疏松,渗透性高的组织。一般来说,结构疏松,渗透性高的组织多选择大分子染料,而结构致密,渗透性低的组织多选择小分子染料。常用作胶原纤维染色的几种阴离子染料的分子量由小到大分别是:苦味酸(黄色),分子量,229.11橙黄G(橙黄色),分子量452丽春红(红色),j女子量,480.42酸性品红(红色),分子量,585.53苯胺蓝(蓝色),分子量737.72亮绿(绿色),分子量792.72甲基蓝(蓝色),分子量,799因此,在VanGieson氏法中,苦味酸染红细胞和肌纤维,酸性品红染胶原纤维,而在Masson氏法中,酸性品红或丽春红染肌纤维,而苯胺蓝或亮绿染胶原纤维。染色反应是一个很复杂的过程,胶原纤维染色除上述两个方面外,不排除电子吸附和排斥作用。在实际染色中,两种阴离子染料的比例也是很重要的。在VanGieson氏染色,苦味酸与酸性品红浓的比例若不恰当,如