仪器分析课件-荧光一

第十四章荧光分析法第一节概述某些物质受到光照射时，吸收某种波长的光之后，会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停止照射，这种光线也随之消失，此种光称为荧光(fluorescence)。含有少量Cr3+的钇铝石榴石绿色晶体用兰色激光照射石榴石绿色晶体时,Cr3+吸收兰光并辐射出能量较低的红色荧光.晶体的荧光现象荧光分析法x−射线荧光分析法紫外−可见荧光分析法红外荧光分析法根据激发光的波长范围分子荧光分析法原子荧光分析法化学发光光致发光根据激发所用能源根据待测物质的存在形式优点：A.灵敏度高，检出限10-10~10-12g/ml（紫外：10-7g/ml)B.选择性好。C.试样量少和方法简便D.提供比较多的物理参数缺点：应用范围较窄干扰因素多二、基本原理在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…；电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；自旋量子数：1/2;-1/2;单重态：2S+1=1三重态：2S+1=3电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁•振动弛豫：从同一电子能级的各较高振动能级逐步返回到最低振动能级。•内部能量转换：两个电子能级之间的能量转换。•外部能量转换：激发态分子与溶剂分子或其它荣指分子相互作用及能量转移。•体系间跨越：指不同多线态间的无辐射跃迁。激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；第二激发态单线态基态第一激发态单线态第一激发态三线态S1VnT1S0S2λ′λ1(f)磷光(d)荧光(a)吸收V1V4V3V2(b)振动驰豫(b)λ2V0(e)体系间跨越V0V0V0V2V2V2V4V4V4V3V3V3V1V1V1图13-1荧光与磷光产生示意图（c）内部能量转换荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；发射波长为’2的磷光电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。’221；200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱三、激发光谱与发射光谱荧光物质分子都具有两个特征光谱，即激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如’2)。但是荧光强度与激发波长有关。吸收越强，发射荧光强度越大，故常选最大激发波长光作激发光c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。第三节荧光与分子结构的关系一、分子结构与荧光的关系（一）荧光物质的必要条件分子产生荧光，必须具备两个条件：（1）物质分子必须有强的可见-紫外吸收分子结构应具有共轭结构（或含不饱和杂原子基团），产生跃迁或跃迁***n（2）分子吸收辐射能后，必须具有一定的荧光量子产率。即荧光效率（）应足够大。通常：01fj吸收激发光的量子数发出荧光的量子数=fjfj（二）分子结构与荧光的关系1.跃迁类型：K带强吸收激发:发射:2.长共轭结构物质，易产生共轭程度越大，产生荧光强度越强，荧光效率越大，波长长移。*n100~10*410弱n**强*例：苯萘蒽9-乙烯蒽λex205286356λem278321404432φf0.110.290.360.76共轭键越长，荧光强度越大，荧光波长长移。CH=CH23.分子刚性和共平面性结构（刚性共平面结构）大多数具有刚性共平面结构的有机物具有强烈的荧光例：联苯芴CH22.0=fj0.1=fj例酚酞荧光极弱荧光素荧光强烈COC=OHOOHCOC=OOHOOH例1：哪个荧光强度强？8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁NONOHMg1/2弱荧光物质强荧光物质1-二甲胺基-7-磺酸盐1-二甲胺基-8-磺酸盐SO3NaNCH3CH3SO3NaCH3NCH3（位阻效应）φf=0.75φf=0.03C=CHHC=CHH反式二苯乙烯顺式二苯乙烯有强荧光无强荧光4.取代基（1）对共轭体系作用大的给电子基团，增加共轭效应，使荧光效率增强，荧光波长长移。例：-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR2等饱和杂原子基团。（2）对共轭体系作用大的吸电子基团，减弱π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。例：-COOH，-NO2，-C=O，-NO，-SH，-NHCOCH3，-F，-Cl，-Br,-I等。OHNO2荧光波长270~310285~365nm荧光强度10180例：（3）对共轭体系作用效小的基团，对荧光的影响不明显。例：-R，-SO3H，-NH3。三、影响荧光强度的外部因素1、溶剂一般：溶剂极性增大，荧光强度增大，波长长移。溶剂粘度减小，荧光强度减弱。8-巯基喹啉的荧光峰位置和荧光效率与溶剂介电常数的关系溶剂介电常数荧光峰位λnm荧光效率φfCCl42.243900.002CH3Cl5.23980.041丙酮21.54050.055乙腈38.84100.0642、温度温度升高，荧光强度下降3．溶液PH值PH值会影响酸或碱的离解，因此，PH值不同，物质荧光强度也不同例pH2不发光pH13不发光pH7~12蓝色荧光适宜酸度：pH7~12NH3+NH2NH-OH-H+OH-H+4．氢键的影响5．散射光的干扰散射光：当一束平行的光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变，而向不同角度散射，这种光称为散射光。散射光有两种：瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量交换，仅是发生运动方向改变拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，光子的运动方向及能量均发生改变，这种散射光称拉曼光。瑞利光波长与激发光波长相同拉曼光波长比激发光波长长。消除拉曼光干扰的方法是：测量时选择适当的激发波长ab荧光强度300400500λnm图13-3硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱a、激发光谱b、荧光光谱320nm350nm图12一-6硫酸奎宁与空白溶剂在不同波长激发下的荧光与散射光谱320nm360nm448nm激发光320nm硫酸奎宁350nm400nm350nm320nm360nm448nm激发光350nm硫酸奎宁激发光320nm0.01mol/LH2SO4激发光350nm0.01mol/LH2SO4思考题•如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？6.荧光熄灭剂荧光熄灭：指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂例：-X，Cu2+、Zn2+等。O2、-NO、-COOH等1、碰撞，损失能量2、相互作用生成不发光的配合物3、引入溴或碘，发生体系间的跨越4、O2的氧化，或氧分子的顺磁性促进体系间的跨越，单线态转至三线态。5.熄灭剂分子和荧光物质分子间的相互作用有选择性。7.表面活性剂的影响表面活性剂形成的胶束溶液，有增溶、增稳和增敏作用，可大大提高荧光分析法的灵敏度和稳定性。第四节荧光分光光度计光源激发单色器样品池检测器发射单色器I0狭缝表面吸光物质狭缝狭缝放大器指示器记录器仪器结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角，样品池四面透光。光源：强度大，高压氙灯、汞灯、氙－汞弧灯、闪光灯和激光器，应用最广泛的是高压氙灯。检测器：光电倍增管。二、仪器类型：1）滤光片荧光计（930）2）滤光片——单色器荧光计3）荧光分光光度计光源第一滤光片光栏样品池第二滤光片光栏检测器放大及记录光电荧光计示意图（930型）仪器光路图三、荧光计的校正1、波长校正用汞灯的标准谱线来校正2.灵敏度校正灵敏度：用检出限表示检出限：用某一标准荧光物质的稀溶液在一定激发波长的照射下，能发射出最低信噪比时的荧光强度的最低浓度灵敏度影响因素：（1）光源强度（2）单色器（包括透镜、反射镜等)的性能（3）放大系统的特征（4）光电信增管的灵敏度（5）测定波长狭缝宽度溶剂的Raman散射激发光、杂质荧光由于荧光光度计灵敏度的影响因素很多，因此，每次测定时先用一种稳定的荧光物质，配成浓度一定的标准溶液进行校正,（调50%或100%）（1）标准溶液本身（荧光稳定）（2）硫酸奎宁标准溶液（1μg/ml,0.05mol/LH2SO4溶液）3、激发光谱和荧光光谱的校正目前多采用双光束光路.第五节定性与定量一、定性分析一般用纯品作为对照测定激发光谱和荧光光谱或光谱数据（λex和λem）进行定性。二、定量分析1.荧光强度与浓度的关系低浓度时：F=KC由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光的，因此，溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。溶液中荧光物质被入射光激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度。推导：在与入射光垂直的方向上测量荧光强度，为了消除入射光和散射光的影响。I0IF1、荧光强度正比于吸收的光强度与荧光量子数afIFj=aI：吸收的光强度2、依据Lambert-Beer定律：EClaIIIII==10000)101(0EClI=)101(0EClfIF=j)1(3.20EClfeI=j式中()()+..+++=3303.223.21)3.2(13213.2EClEClECleECl﹗﹗﹗ECleECl3.213.2=时当05.0ECl()EClIFf3.2110+=jEClIf03.2j=当入射光强度I0一定，则KCF=注：只有浓度极稀的条件下，上式才成立荧光分析法：定量依据：F=KC灵敏度取决于：仪器灵敏度1、灯源强度大：氙灯，高压汞灯。2、高灵敏度的检测器：改进光电倍增管和放大系统，放大荧光强度紫外-可见分光光度法：定量依据：A=ECl=kCA=-lgT=-lgI/I0检测的是I/I0，即使放大光强信号，I/I0比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，故：紫外-可见分光度法灵敏度低于荧光分析法灵敏度（二）、定量分析方法1、标准曲线法（1）配置空白溶液，标准溶液、样品溶液C0C1C2C3C4C5……Cx（2）仪器凋零（3）用浓度最大的标准溶液（C5）,寻找背景最低,荧光最强的激发光波长和荧光波长（4）分别测量各溶液的荧光强度F0F1F2F3F4F5Fx（5）计算荧光强度校正值（6）作Fi－F0~Cs标准曲线，求回归方程（8）求样品含量0FFFi=2、比较法要求：标准曲线过原点Cs与Cx相近（1）配CsCxCo(2)测FsFxFo(3)计算：Fs-Fo=KCsFx-Fo=KCxxsxsCCFFFF=003、多组分混合物荧光分析依据：F=KC荧光强度具有加和性方法：解线性方程组1、