基因工程(根据汉水丑生老师思路)

基因工程基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因工程：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。一、DNA重组技术的基本工具•准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制酶•DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶•基因转移工具（“分子运输车”）——运载体1、限制酶识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。EcoRⅠ黏性末端黏性末端限制酶切割的是什么？两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键.磷酸二酯键磷酸二酯键基因工程的基本操作程序•（1）目的基因的获取•（2）基因表达载体的构建•（3）将目的基因导入受体细胞•（4）目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，每个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大某种生物的部分基因某种生物的全部基因真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子内含子：外显子：基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR——多聚酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链过程：高温变性、低温退火、适温延伸三步曲1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？（24-1）×2=30PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制主要在细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成（三）人工合成法-----不需要模板二、基因表达载体的构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。——基因工程的核心a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切断目的基因，使其产生_________________。将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶过程:注意：载体与表达载体的区别二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构使用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使其露出相同的黏性末端，再加入DNA连接酶。三、将目的基因导入受体细胞转化目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射转基因受精卵转基因动物3、将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌：大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测四、目的基因的检测与鉴定青霉素抗性基因四环素抗性基因大肠杆菌1、鉴定——分子水平的鉴定（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因方法——DNA分子杂交技术DNA分子杂交技术DNA分子杂交技术1、鉴定——分子水平的鉴定方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA1、鉴定——分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。（一）植物基因工程技术的应用1、提高农作物的抗逆能力（1）抗虫转基因植物三、基因工程的应用（2）抗病转基因植物抗病转基因植物所用的基因：①常用：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因②抗真菌转基因植物中有：几丁质酶基因和抗毒素合成基因（3）其它抗逆转基因植物①抗盐碱、干旱的基因：调节细胞渗透压的基因②抗冻蛋白基因③抗除草剂基因2、改良农作物的品质富含赖氨酸的转基因玉米导入与植物花青素代谢有关的基因的矮牵牛3、利用植物生产药物二、动物基因工程前景广阔（一）用于提高动物生长速度——动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等导入外源生长激素基因（二）用于改善畜产品的品质举例说明将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。（三）用转基因的动物生产药物设问:就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，将受精卵送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。乳腺生物反应器①获取目的基因（例如血清白蛋白基因）②构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）③显微注射导入哺乳动物受精卵中④形成胚胎⑤将胚胎移植入母体动物⑥发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体的乳腺细胞中，转入的基因才能特异表达）。思考:用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？膀胱生物反应器目的基因在膀胱上皮细胞中特异性表达（四）用转基因动物作器官移植的供体利用基因工程对猪的器官进行改造方法：将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官三、基因工程药品异军突起工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。四、基因治疗曙光初照把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。（把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的）体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。（如将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者肺组织）DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。基因诊断五、基因芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。----DNA探针阵列蛋白质三维结构氨基酸序列多肽链基因DNA预期功能DNA合成分子设计mRNA生物功能转录翻译折叠蛋白质工程流程图蛋白质工程目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。蛋白质工程的概念•蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。即：通过修改基因来改变蛋白质分子中的氨基酸，从而制造出具有新特征的蛋白质。蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸比较项目蛋白质工程基因工程蛋白质实质应用现状相同点合成自然界不存在的蛋白质天然存在的蛋白质改造基因基因重组对现有蛋白质进行改造，对创造新的蛋白质还未成功已被广泛应用蛋白质工程与基因工程的异同都要改造基因，都属于分子水平