基因工程―诞生、原理、技术、应用

专题一基因工程高考考纲要求:（1）基因工程的诞生Ⅰ（2）基因工程的原理及技术Ⅱ（3）基因工程的应用Ⅱ（4）蛋白质工程Ⅰ实验：DNA的粗提取与鉴定专题一基因工程一、基因工程的定义按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。供体生物目的基因剪切和拼接，建构重组DNA分子受体细胞也称基因拼接技术或DNA重组技术二、基因工程的理论依据DNA是绝大多数生物的遗传物质，不同生物的DNA的基本单位和结构相同中心法则：DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录复制基因是遗传物质结构和功能的基本单位各种生物共用一套遗传密码三、DNA重组技术的基本工具1、限制性核酸内切酶——分子手术刀来源：主要从原核生物中分离提纯特点：高度的专一性多样性识别并切割特定的某种核苷酸序列已经分离出4000种作用：识别双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列，含有4～8个核苷酸中心轴线两侧的碱基反向对称重复排列如EcoRⅠ酶，从中轴线两侧切开，如SmaⅠ酶，沿中轴线处切开，平切：错位切：形成平末端形成黏性末端并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开2、DNA连接酶——“分子缝合针”将双链DNA分子的两个片段连接起来——通过形成磷酸二酯键E.coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏性末端或平末端DNA连接酶与DNA聚合酶功能的区别：DNA连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键而连接起来DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键而连接起来3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”作用：将目的基因（外源基因）送入受体细胞条件：有一个或多个限制酶切割位点在受体细胞中能自我复制，或者能整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制带有标记基因，便于甄别和筛选安全，对受体细胞无害大小合适，方便操作种类：质粒（经人工改造，常用）、λ噬菌体衍生物、动植物病毒、农杆菌等四、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取⑴从基因组文库中获取目的基因将某生物的基因组进行切割，获得一批长度为15—20kb的DNA片段将上述DNA片段分别与运载体结合，再分别导入受体菌群体的各细胞中储存、复制需要时通过一定方法从基因组文库中获取目的基因——构建成该生物的基因组文库限制酶⑵利用反转录法获取目的基因单链DNA（cDNA）提取某生物细胞中的mRNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA受体菌细胞中储存、复制，建构cDNA文库PCR技术扩增获取目的基因一定方法导入RNA—DNA杂交分子RNA酶降解RNA链⑶直接提取后利用PCR技术扩增而获取目的基因以探针从生物细胞中提取目的基因利用PCR技术扩增目的基因⑷人工合成目的基因DNA合成仪合成双链DNA（目的基因）碱基序列已知测定某蛋白质中氨基酸的排列顺序利用密码子表推测mRNA中碱基排列顺序DNA反义链的碱基排列顺序利用碱基互补配对原则推测化学合成真核生物的基因结构非编码区非编码区编码区外显子内含子初级mRNA翻译蛋白质启动子终止子转录加工成熟mRNAPCR技术（聚合酶链式反应）——人工扩增DNA技术引物原理：DNA的半保留复制反应系统：微量DNA样品DNA聚合酶4种游离的脱氧核糖核苷酸——模板——dATP、dTTP、dGTP、dCTP——人工合成的含有20个碱基的核苷酸序列（过量）（过量）退火（55～60℃）,与引物互补在适宜温度下（70～75℃）形成DNA新链反应过程样本DNADNA聚合酶引物提高温度（90～95℃）,DNA变性循环进行DNA数量呈指数方式增加PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要DNA解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般可以经历三十多次循环，短时间内形成大量DNA片段；而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制，形成整个DNA分子。2、基因表达载体的构建一个基因表达载体包括：启动子目的基因终止子标记基因其他——RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动基因转录——使受体生物表现出更符合人类需求的性状——结束转录——鉴别筛选出含目的基因的受体细胞使目的基因稳定存在并遗传使目的基因表达和发挥作用如复制原点、运载体上原有的基因（最核心步骤）3、将目的基因导入受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌提取Ti质粒目的基因构建表达载体感染双子叶植物目的基因整合目的基因插入受体细胞染色体DNA裸子植物目的基因随染色体DNA复制并表达常用农杆菌转入基因枪法（适用于单子叶植物）花粉管法柱头子房壁胚珠萌发的花粉粒花粉管精核卵细胞极核目的基因简便经济（2）将目的基因导入动物细胞——显微注射技术提纯表达载体显微注射仪注射受体动物受精卵移植雌性动物输卵管或子宫内发育具有新性状的动物（转基因动物）（3）将目的基因导入微生物细胞常态细菌Ca2+处理感受态细胞表达载体DNA细菌吸收被转化的细菌（含目的基因）混合4、目的基因的检测与鉴定以被标记的目的基因作探针，与转基因生物基因组DNA杂交，观察是否出现杂交带以被标记的目的基因作探针，与转基因生物提取出的mRNA杂交，观察是否出现杂交带检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出mRNA——分子杂交技术——分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质目的基因表达的蛋白质（抗原）刺激产生相应抗体从转基因生物体内提取蛋白质抗原—抗体杂交观察是否出现杂交带检测转基因生物的性状——抗原—抗体杂交技术观察或测定是否出现目的基因所决定的性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等人胰岛细胞胰岛素mRNABC①②③④⑤胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。下图是利用基因工程技术生产人胰岛素时扩增目的基因的过程。请据图回答。（1）人体内能产生胰岛素mRNA的细胞是细胞，不能利用人的皮肤细胞来完成①过程的理由是，检测胰岛素mRNA常用的技术是。（2）与④相比，②不同的碱基配对方式是。（3）若胰岛素mRNA中鸟嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤分别占碱基总数的32%、26%和19%，则B中含有腺嘌呤%。胰岛B胰岛素基因在皮肤细胞中不能表达分子杂交技术U－A21（4）若C为具有生物活性的人胰岛素基因，要使其在大肠杆菌体内成功表达，还要进行的操作步骤依次是：，和目的基因的检测与鉴定。基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞（5）人的胰岛素基因能在大肠杆菌体内得以成功表达，主要是因为人和大肠杆菌。共用一套密码子