食物中毒的判别及检验

食物中毒案例PPT制作：PPT讲解：PPT整理：案例回顾•B市C镇初级中学为政府公办初级中学，共有学生1132名，22个班级，83名老师，7名食堂工作人员。其中寄宿生630名，走读生502名，周一至周五上课，周六至周日放假。根据学校报告，6月5日下午17：20开始，有学生出现腹痛、腹泻、呕吐、恶心和头痛、头昏等症状，到6月6日晨检发现有80余名左右出现同类症状，因这些学生在学校有共同就餐史，且发病时间非常集中，怀疑为食物中毒。6月6日上午7：30学校向C镇卫生院报告并组织患病学生就诊。(其他的详细信息见教案)非细菌性食物中毒初步筛查（直接涂片，呕吐物、粪便）分离培养平板分离快速检验（PCR）全面生化检验、血清学检验血常规粪常规以及粪便、呕吐物病原学检验血清学鉴定增菌培养细菌性食物中毒判断为什么类型的中毒事件溯源食堂工作人员患者共同食用食物食堂用水咽拭子、肛拭子临床检验蔬菜肉、鸡蛋油卫生学指标（菌落总数、大肠菌群）购买地、种植地购买地、养殖地购买地、种植地（酸价、真菌毒素等）进行整治食物中毒相关概念食物中毒：摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的•食物中毒可分为细菌性和非细菌性食物中毒细菌性食源性疾病细菌性食源性疾病：是进食被细菌或细菌毒素污染的食物而引起的感染性或中毒性疾病。细菌性肠道传染病（霍乱、痢疾、伤寒副伤寒等）短期内集中发病常被诊断为细菌性食物中毒散发或潜伏期较长病例常被诊断为胃肠炎或其他疾病细菌性与非细菌性食物中毒区别细菌性食物中毒非细菌性食物中毒病原体细菌动物性，化学物质，原因不明中毒原因主要为动物性食品特殊食品或误食有毒成分活菌或肠毒素特殊毒素或毒物潜伏期1-24h（肉毒1-5d）快速，甚至仅数分钟临床特点多伴有发热，胃肠炎（除肉毒）胃肠炎症状，常伴神经、血液系统症状预后良好不及时治疗，预后差治疗一般可用抗生素（除肉毒）促排，及时给予特效解毒剂预防防止污染，控制繁殖，彻底杀灭加强宣教，防止误食细菌性食物中毒的特点与饮食有密切关系，去除原因食品后，不再有新的患者。临床症状以急性胃肠炎为主，基本相同。短时期内多人发病，无人传染人的现象。中毒发生与不同区域人群饮食习惯有密切关系。与季节相关。细菌繁殖条件及人体防御机能。发病率高，病死率较低、恢复快、多数预后良好细菌性食源性疾病的流行病学传染源：被病原菌感染的动物或人传播途径：通过进食被细菌或其毒素污染的食物人群易感性：普遍，无病后免疫力，可重复感染流行特征：夏秋季高发；病例可散发或爆发流行；发病急，时间集中，潜伏期短；有共同进餐史；症状轻重与进食量有关。细菌性食物中毒还是病毒性食物中毒？•细菌性食物中毒：WBC增加，中性粒细胞增加；•病毒性食物中毒：淋巴细胞和单核细胞增高•根据流病资料、病例的三间分布，与患者临床表现、病患血常规检查结果：•1.病患有共同进餐史；•2.病例潜伏期最短为5小时，最长为47小时。中位数为13小时，具有明显的时间聚集性；•3.案例皆来自于学校，具有地点聚集性；•4.呕吐或24h内腹泻3次及以上，恶心、腹痛、（典型的胃肠炎临床症状）发热等临床症状；•5.病患血常规检测共收集了140人的血常规结果，白细胞升高占28%，中性粒细胞升高占61%。部分病例碱性磷酸酶升高。•判断为细菌性食物中毒。•由于患者主要临床表现为头痛头晕、腹痛、腹泻（黄色水样便）、呕吐、恶心、乏力等症状，部分病例低热等，初步怀疑为患者感染的可疑菌可能为以下几种。病原菌临床症状特征食品标本沙门菌多数起病急骤，畏寒发热，体温一般38～39℃，伴有恶心、呕吐，腹痛，腹泻，大便每日3～5次至数十次不等，大便常为水样禽、蛋、肉（交叉污染的进口物）食品：血清分型培养病例：血清分型培养食品加工者：粪便、血清培养副溶血弧菌腹痛、呕吐、腹泻及水样便等症状。海产品食品／病例埃希氏大肠菌⒈产毒大肠杆菌水样腹泻、腹痛、恶心、低热。每天腹泻可达8～12次。生蔬菜食品：定性培养和血清分型病例：粪便培养、血清分型和肠毒素产生；侵袭性试验⒉。侵袭性大肠杆菌发热、剧烈腹痛、水样腹泻、粪便中有少量粘液和血。沙拉，水，奶酪⒊。肠出血性大肠杆菌（E.coliO157:H7和其它）不典型一般3～10天发病，常有突发性的腹部痉挛，有时类似于阑尾炎的疼痛。有的病人只有轻度腹泻；有些病人由水样便，转为血性腹泻，牛肉，生奶志贺菌属起病急，发热、腹痛、脓血便、水样便并有中度全身中毒症状。被感染的操作者污染食品，通常不是食物传染的食品：粪培养和血清分型病例／操作者：粪便培养和血清分型产气荚膜梭菌腹痛、腹泻，多为水样便，一般无脓血便，可伴有头痛、无力及发热。肉、禽类食品：肠毒素检测，定性培养和血清分型小肠结肠炎耶尔森氏菌发热、腹痛、水样腹泻、呕吐、关节炎、败血症、胃肠炎症状、发热、亦可引起阑尾炎。被感染的人或低等动物污染的食品冷藏食品食品：定性培养操作者：粪便培养动物：粪便，生病动物的尸检材料培养霍乱弧菌（症状与）上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌感染者污染的食物或从污染的环境获得食品：血清分型病例：血清分型蜡样芽孢杆菌骤起腹痛、腹泻、水样便，恶心，呕吐较少，少数患者有发热。调味酱、米粉、布丁、香肠、肉块食品：定性培养病例：粪便培养金黄色葡萄球菌呕吐、发热、腹泻、黄绿色糊状便；重症呈暗绿色水样便海水样便。粘液多，有腥臭味，有时可排出片状伪膜。火腿／肉片／调味酱／奶油食品：肠毒素检测食品加工者：培养鼻孔、皮肤病变病人：粪便、呕吐物细菌性食物中毒实验室应急检测程序初步筛查直接涂片检查分离培养检验1.增菌培养、平板分离培养2.快速检验（PCR）3.全面生化检验与血清学检验•直接涂片•取新鲜病患的粪便标本涂片，空气自然干燥后火焰上加热固定，革兰氏染色镜检。•若镜检有鱼群状排列弧菌，可怀疑为霍乱弧菌。•增菌培养⑴需氧菌增菌培养基7.5%NaCl肉汤金黄色葡萄球菌葡萄糖肉浸液肉汤溶血性链球菌TTB、SC增菌液沙门氏菌志贺氏菌增菌液志贺氏菌3.5%NaClAPW副溶血性弧菌肠道菌增菌液EC病原性大肠埃希氏菌⑵厌氧菌增菌庖肉培养基产气荚膜梭菌、肉毒梭菌•直接平板培养将处理后的检样直接接种于各种平板培养基上⑴需氧培养普通琼脂平板蜡样芽孢杆菌及其他未知菌血平板葡萄球菌、链球菌、蜡样芽孢杆菌伊红—美蓝培养基大肠埃希氏菌、变形杆菌麦康凯培养基大肠埃希氏菌、变形杆菌HE、SS培养基沙门氏菌、志贺氏菌TCBS培养基副溶血性弧菌⑵厌氧培养葡萄糖血琼脂平板产气荚膜梭菌、肉毒梭菌CCDA空肠弯曲菌快速检测：PCR用上述方法培养的增菌液1mL8000r/min离心5min50μLDNA提取液1.5mL无菌离心管12000r/min离心5min吸弃上清液沸水浴5min取上清液保存于-20℃备用以待检测，-70℃可长期保存PCR扩增细菌模板DNA提取PCR扩增•1.设置对照空白对照阴性对照阳性对照蒸馏水非目标菌的DNA含有检测序列的DNA或质粒PCR扩增•2.反应体系•根据不同待测菌选择相对应引物与反应参数PCR扩增•扩增产物电泳检测•1.用电泳缓冲液制备1.8%-2%琼脂糖凝胶，55℃-60℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/mL•2.取8-15μLPCR扩增产物，分别与2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照。•3.3V/cm-5V/cm恒压电泳20-40min后用凝胶成像分析系统记录保存。PCR结果判定•若阴性对照与空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品未出现相应大小扩增条带，则报告为检验结果阴性。•若待测样品出现相应大小扩增条带可判定结果为假定阳性，此时用传统检测步骤进行确认，最终结果以后者检测结果为准。传统手工鉴定•1.分离•分别用接种环取上述沙门菌增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板于36℃±1℃分别培养18h～24，BS琼脂平板培养40h～48h。观察平板上的菌落特征。传统手工鉴定•2.生化反应•2.1•自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。观察菌落特征。初步生化:三糖铁（TSI）现象说明底层黄色葡萄糖阳性红色或不变色葡萄糖阴性黑色产H2S气泡产气斜面黄色乳糖和（或）蔗糖阳性红色或不变色乳糖和（或）蔗糖阴性传统手工鉴定•2.2、接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按下表判定结果。•将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。传统手工鉴定•2.3初步生化结果判定•反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。传统手工鉴定•2.3初步生化结果判定•反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。•反应序号A3：补做ONPG*。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。•（*：邻硝基酚-β-D-半乳糖苷溶液试验：将待检培养物接种3%氯化钠三糖铁琼脂，36℃±1℃培养18h。挑取1满环新鲜培养物接种于0.25mL3%氯化钠溶液，在通风橱中，滴加1滴甲苯，摇匀后置37℃水浴5min。加0.25mLONPG溶液，36℃±1℃培养观察24h。阳性结果呈黄色。阴性结果则24h不变色。）传统手工鉴定•3.血清学鉴定•3.1多价菌体抗原（O）与多价鞭毛抗原（H）鉴定•在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清或多价鞭毛（H）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。传统手工鉴定•3.2血清学分型•用抗血清对所分离菌种的菌体O抗原、表面Vi抗原、第I相和第II相H抗原进行凝集试验•用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。•多价抗血清凝集后再用分别代表每个O血清群的单价因子血清定群。再按照确定的O群，分别用H因子血清检测第I相和第II相H抗原，综合O、H以及Vi因子血清检查结果，判断沙门氏菌的血清型。关于收集到的病患的检验一：粪便粪便常规：病患粪便标本：在接收到的病患粪便标本之后，进行粪便常规检查，并且对其增菌培养后进行病原学检查目的：粪便常规检查是为了查看WBC、RBC,有无隐血，是否为侵袭性的。在显微检查的时候也可看有无可疑虫卵或可疑菌（若为霍乱弧菌则可在图片上看到逗号状鱼群样排列的菌群）；做增菌分离培养是为了做病原学检查，看有无沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌等（实验室内细菌的常规检查）。二：病患的呕吐物标本•呕吐物常规检查：接收到标本后做涂片检查、隐血实验和增菌分离培养目的：涂片检查是为了检查有无可疑虫卵，隐血实验是为了检查是否有上消化道出血。•1.血清学实验：将病人急性期（病人刚进医院未接受任何治疗时）和恢复期（治疗一周之后）的血清与所分离的病原菌做抗原和鞭毛试管凝集试验，如恢复期血清凝集效价较发病初期有4倍以上升高，则有诊断价值。•2.血常规：检查病患血液中的RBC、WBC