第十篇 甾体激素类药物分析

第十章甾体激素类药物的分析基本结构：环戊烷骈多氢菲C20C21ABC12345678910111213141516171819D第一节基本结构与分类分类：甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素OHOOHOCH2OHHHH一、肾上腺皮质激素氢化可的松OHOOHOHFHOCH3OHCH3醋酸地塞米松主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–α–醇酮基还原性OOHHHHOCH3二、雄性激素及蛋白同化激素丙酸睾酮OOHHHHO苯丙酸诺龙主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–β–羟基(可)成酯COHHHCH3O孕激素黄体酮主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–甲酮基与亚硝基铁氰化纳反应C17–乙炔基与AgNO3反应CHOHHHOHCH雌激素炔雌醇主要活性基团性质A环为3–OH苯环UV、与重氮苯磺酸盐反应C17–乙炔基与AgNO3反应C17–羟基可成酯第二节鉴别试验一、物理常数的测定1、熔点：2、比旋光度：偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光物质1g的溶液，在一定的波长和温度下测得的旋光度。如醋酸地塞米松：二氧六环中10mg/ml下比旋度+82~88º3、吸收系数：如醋酸地塞米松在无水乙醇中240nm（15g/ml）吸收系数为343~371（一）与强酸的呈色反应（母核）甾体激素类药物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl二、化学鉴别法与硫酸显色反应显色荧光加水稀释泼尼松龙深红絮状↓灰泼尼松橙黄→蓝绿炔雌醚橙红黄绿↓红色炔雌醇橙红黄绿絮状↓玫红醋酸可的松黄或微褪色并澄带橙清(二)官能团的反应肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐OHˉ1、C17–α–醇酮基还原性A.呈色反应B.沉淀反应肾上腺皮质激素药物氨制硝酸银Ag↓黑色碱性酒石酸铜Cu2O↓橙红色甾酮类激素药物呈色羰基试剂2.C3–酮基和C20–酮基常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼OOHNCONHNH2HClCONHNOHN异烟腙（黄色）睾酮OCCH3O2NCONHNH2HCl黄体酮CONHNCCH3NHNOCNN异烟双腙（黄色）具有甲酮基或活泼亚甲基药物呈色亚硝基铁氰化纳间二硝基酚芳香醛3.甲酮基黄体酮其他甾体亚硝基铁氰化钠蓝紫色淡橙色不显色COCH3O黄体酮]NOCNFe[OHH2O2+-4Fe5CNNOCHCOO蓝紫色含炔基的甾体激素银盐沉淀硝酸银5.乙炔基AgNO3RCCHRCCAg↓4.酚羟基雌激素类药物重氮苯磺酸红色偶氮染料炔雌醇OHCCHHOOHCCAgHO白3AgNO有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ6.有机卤素茜素氟蓝硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓呈色（蓝紫色）OOOHOHCH2NCH2COOHCH2COOH茜素氟蓝OOOHOCH2NCH2COOCeCH2COOFOH蓝紫色F-Ce7.酯的反应C17或C21位上羟基的酯，水解产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质进行鉴别。如：KOHOCOCHR醇制香OCOCHCHCHSOHOHHC戊酸戊酸雌二醇醇制NaOHH特臭己酸己酸羟孕酮醇制OHH特臭℃~.p.m睾丸素丙酸睾酮醇制KOH△分解℃约.p.m盐酸氨基脲苯丙酸诺龙△缩氨基脲衍生物三、制备衍生物测定m.p.（一）缩氨基脲的生成（二）酯的水解△４-3-酮240nm苯环280nmOCCCCCCCCC四、UV法结构特征：酚羟基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇OHCCHHO五、IR法六、TLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。七、HPLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）方法：对照品法要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。第三节特殊杂质检查一、有关物质的检查来源：原料、中间体、异构体、降解产物特点：（1）可能存在多个甾体杂质（2）结构类似方法（具有一定分离能力）：TLC法（高低浓度对比法）；HPLC法（主成分自身对照）（一）TLC法（高低浓度对比法）判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色醋酸氟轻松:检查有关物质取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97:3）为展开剂，展开后晾干，在105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。特点：（1）简便易行，不需特殊的仪器；（2）不需对照品；（3）只能控制单个杂质的限量；（4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。（二）HPLC法（高低浓度对比法）判定方法：规定杂质峰数目规定杂质峰面积特点：（1）需特殊的仪器；（2）不需对照品；（3）可以控制杂质的总量；来源：合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢原理及方法：nmA环己烷苯并苯硒二唑二氨基萘,Se,..pHSeSe盐酸羟胺氧瓶燃烧二、硒的检查醋酸氟轻松检查硒取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.00.2后，转移至分液漏斗中，用水少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（1→2）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基萘试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2′，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。规定A供＜A对。三、有机溶剂残留量的检查（甲醇和丙酮）甲醇≤0.3%丙酮≤5.0%GC法内标法定量原理及方法：供试液对照液钼酸铵磷钼酸铵H+还原磷钼酸蓝（钼蓝）740nmA样A对四、游离磷酸盐的检查检查游离磷酸地塞米松磷酸钠精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放置30～50分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。一、HPLC法各国药典多采用RP－HPLC（大多内标法）特点用样量少，灵敏度高，分离效果好,测定速度快.甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰。第四节含量测定二、UV法△４-3-酮240nm肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯环280nm（±）雌激素肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基强还原性1.原理OH-[还原](一)四氮唑比色法有色甲臜四氮唑盐醇酮基aC三、比色法CNNNNH三苯甲臜↓深红CNNNN+Cl-氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（RT）nm~max490480OHe2Cl-+CNNNNOCH3+-ClCNNNNOCH3蓝四氮唑（BT）OHe4HCNNNNOCH3HCNNNNOCH3双甲臜（暗蓝）nmmax5252.方法对照品法℃氢氧化四甲基铵对照液供试液25ATTC40～45′暗3.讨论（1）基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯21位酯化后反应速度减慢，酯化基团越大反应速度越慢（2）溶剂、水分的影响含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→几无反应—无醛无水乙醇醛→A↑—无水乙醇（3）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行以氢氧化四甲基铵的结果最佳碱试液四氮唑盐皮质激素溶液加入顺序：（4）O2与光线的影响反应过程反应产物怕光→避光、快速O2影响颜色强度和稳定性→隔绝空气、快速、充N2（5）温度与时间t℃↑→ν↑→甲臜分解↑→%↓ChP25℃40～45′BP30℃1h肾上腺皮质激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基1.原理异烟腙（黄）酮基异烟肼CHCl（缩合）(二)异烟肼比色法CONHNOHN异烟腙（黄色）2.方法：℃异烟肼挥去乙醇对照液供试液ACHCl暗45′对照品法A供A对＝C供C对C供＝A供A对×C对（1）溶剂的选择异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇无水甲醇无水乙醇3.讨论酸、异烟肼的量(2)盐酸:异烟肼=2:1（3）水分、温度、O2与光线的影响含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不挥发溶剂、不吸收水分时→O2与光线无影响温度t℃↑→ν↑反应速度（4）C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应反应专属性C3－酮基1.原理λmax=465λmax=515雌激素（三、）Kober反应比色法：桃红黄色雌激素乙醇OHSOH△△OHCH3O雌二醇-3-甲醚CH3CH3OCH3CH3Oλmax=465λmax=515SOHSOHOH四、非水溶液滴定法五、生物样品中甾体激素的分析