中药指纹图谱

第五章中药指纹图谱本章学习要求★掌握中药指纹图谱分析及评价▲熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求●了解中药指纹图谱测定方法淫羊藿HPLC图谱12批次淫羊藿HPLC的指纹图谱及其共有模式min01020304050mAU0255075100125150175200DAD1A,Sig=270,4Ref=off(YYHZWTP\YYHZWTP000028.D)min01020304050mAU0255075100125150175200DAD1A,Sig=270,4Ref=off(YYHZWTP\YYHZWTP000025.D)min02.557.51012.51517.52022.5mAU050100150200250300DAD1A,Sig=270,4Ref=off(F:\秋芬\YYH-HPLC图谱\YYH-HC2\YYH-HC2000102.D)2.3312.5092.7183.6074.7115.4526.4467.98211.11612.60013.890淫羊藿苷淫羊藿对照指纹图谱第一节概述定义:中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药指纹图谱的基本属性：整体性和模糊性。整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。模糊性：中药化学成分复杂性+次生代谢产物化学成分不确定性，具有无法精密度量的模糊性。指纹图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。特点：(1)通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪。(2)通过指纹图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定。中药指纹图谱的研究成为当前我国中药基础研究的重要领域与热点，研究侧重于:⑴中药指纹图谱的理论探讨；⑵测试指纹图谱的规范化试验；⑶构建指纹图谱的方法学研究；⑷指纹图谱信息化和知识化研究；⑸指纹图谱在提高中药质控指标方面的研究；⑹指纹图谱指导中药材规范化生产方面的研究；⑺指纹图谱在开发中药资源方面的研究；⑻指纹图谱用于研制中药新药等方面的研究。一、指纹图谱的产生与发展(一)指纹图谱的产生指纹(fingerprint)概念起源于法医学，依据每个人的指纹结构上细微处的绝对差别可以鉴识区分不同的人。法医学的指纹分析强调的是个体的绝对唯一性(absoluteuniqueness)。近代指纹分析的概念结合生物技术的发展延伸到ＤＮＡ指纹图谱分析，而且应用范围从犯罪学扩大到医学和生命科学的领域。生物样品的ＤＮＡ指纹图谱分析强调个体的唯一性，侧重于整个物种的唯一性。中药指纹图谱分析借用法医学“指纹鉴定”的概念，但又不同于常规意义的“指纹”含义。根据中药化学成分的复杂性（或模糊性）和有效成分的整体性，在现阶段还不可能将中药复杂化学成分搞清楚的情况下，运用多学科交叉综合技术手段，进行计算机辅助分析检测和评价，寻找同一药材群体化学成分的相似性，即物种群体内的唯一性。通过建立中药指纹图谱，可以全面反映中药所含内在化学成分的种类和数量，进而反映中药的质量。中药指纹图谱是以各种波谱、色谱等技术为依托，是一种综合的、可量化的鉴别中药的手段，是当前评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。建立的中药指纹图谱应满足专属性、重现性和实用性的技术要求。1.指纹图谱的发展阶段：初级阶段:是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。(二)指纹图谱的发展现状高级阶段:即指纹图谱特征和药效相关性研究，指纹图谱的生物等效性研究。中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗透、从单指标向多指标（多维多息）的综合发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，确保中药安全、有效和可控。国内，目前还处在初级阶段。1.针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行大量研究和深入探讨。2.利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱追寻工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。3.通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平。4.逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。在国外，指纹图谱在ＦＤＡ植物药产品工业指南（2000年草案稿）、ＷＨＯ草药评价指南（1996年）以及英国草药典（1986）、印度草药典（1998）、美国草药典（1999-2001，Monographs）中均将其列入。目的是解决多数草药有效成分不明，市场商品无法有效鉴别真伪和控制质量的问题。要求草药制剂生产商提供半成品的指纹图谱以保证品种的真实性和产品的指纹图谱以证明其批间产品质量的一致和稳定。2.指纹图谱的分类指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。⑴按应用对象分类：①中药材(原料药材)指纹图谱②中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱③中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱④中药制剂指纹图谱按测定方法分类:①中药化学指纹图谱指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药化学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意义。色谱指纹图谱：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等光谱指纹图谱：UV、IR、FP、NMR、MS等②中药生物指纹图谱包括：中药材DNA指纹图谱中药基因组学指纹图谱中药蛋白组学指纹图谱中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。中药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级阶段，可确定中药的主要活性物质。第二节中药指纹图谱测定方法一、色谱法色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，中药指纹图谱首推色谱法，其常用的方法有：TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。1.薄层色谱(TLC)：可离线、展开剂灵活多选、色谱后衍生TLC独具的优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，较柱色谱多了色彩这一可比“参数”，并可进一步配合色谱扫描或数码处理得到不同层次轮廓图谱和相应的积分数据。用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描得到扫描图谱，比目测的薄层图谱更为客观准确，还可计算各峰的峰面积与标准峰的比作量化指标，具有指纹意义。现代薄层色谱技术：如高效薄层色谱（HPTLC）、TLC-GC、TLC-IR2.气相色谱(GC)：外界影响因素较少，稳定性较好，检测设备可选性较大。适用于含挥发性成分中药的指纹图谱的研究和应用。新技术：如毛细管气相色谱（CGC）、气相色谱—质谱联用（GC-MS）、气相色谱—傅里叶变换红外光谱联用（GC-FTIR）等，其中最引人注目是裂解气相色谱（用于不能直接使用GC分析的样品）。3.高效液相色谱(HPLC)：稳定性和重现性好、流动相选择性广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点，样品适用范围广。目前已成为构建中药指纹图谱最主要和常用的方法。新的高效通用检测器的发展，如二极管阵列检测器（DAD）、蒸发光散射检测器（ELSD）、电喷雾电离-质谱（ESI-MS）、质谱-质谱（MS-MS）等设备的引入，使得HPLC适用性与分辨率显著提高，从而使复杂样品的分析成为可能，还可对主要色谱峰进行归属。注射用双黄连指纹图谱相关性4.高效毛细管电泳（HPCE）适用于大部分化学成分，特别是生物大分子肽和蛋白的分离，能实现大小分子(如蛋白质和氨基酸)同时分析，得到的指纹图谱能更多的反映中药的成分特性，如动物类中药的指纹图谱研究。中药指纹图谱研究中最常用的两种模式：毛细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)。重现性可通过采用淌度比法、对照品校正法、保留指数法等加以提高。二、光谱法光谱法是指用一定波长的光照射或扫描中药样品，取得特定的图谱和数据。其主要方法有：UV、IR、FS、NMR、MS、AAS等。1.紫外-可见光谱法（UV-VIS）指纹图谱的构建：是多种成分特征吸收光谱叠加而成的复合谱。在一定条件下，中药多成分的复杂组合也有一定规律性，从而在紫外叠加光谱上显示出一定的特异性和稳定性。光谱特征分析：最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸收度比值、吸收峰的数目、峰形、峰高等。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。2.红外光谱（IR）指纹图谱的构建：是多种成分在红外光区域内(4000~400cm-1)总体官能团吸收的叠加。图谱分析：主要着眼于所测得的红外光谱的轮廓特征（全谱图形）的比较，不用将各主要吸收峰归宿，只要在所扫描的波数范围内比较吸收峰的波数、同一波数吸收峰的形状和强度、“指纹区”面貌等方面的差异即可。新技术：如傅里叶变换红外光谱（FTIR）、二维相关红外光谱（2DFTIR）、近红外光谱（NIR）、傅里叶变换拉曼光谱（FT-Raman）等。3.核磁共振波谱法（NMR）在规范的提取分离条件下，植物类中药的1H-NMR图谱与植物品种间存在着严格的对应关系。可通过对1H-NMR指纹图上显示特征共振信号(如化学位移、峰面积、耦合关系等)的分析，来建立中药的1H-NMR指纹图谱。4.质谱法（MS）质谱是按照带电粒子（即离子）的质量对电荷的比值（m/z）和其相对丰度大小依次排列形成的图谱。中药特征提取物置质谱仪中进行电子轰击裂解为不同的碎片，获得提取物中化学成分的MS图，不同中药所含化学成分的种类及组成比例的不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步裂解的碎片离子峰（m/z）亦不一致，故质谱具指纹性较强的特征，可用于中药指纹图谱的测定。三、联用技术中药复方制剂成分复杂采用联用技术建立多维多息特征谱，可较好地解决如何体现中药复方制剂的整体性和复杂性的问题。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的方式来测定指纹图谱，各谱图间相互补充，可对复杂供试品有更清晰完整的认识。常用的是HPLC或CE／DAD／MS-MS)，所得的多维指纹图谱包括色谱峰图，UV图；一级质谱图(各个成分的质量)和二极质谱图(某成分的特征碎片)。（可得到更多的化学结构信息）所谓多息，即指中药复方制剂的特征谱，包括化学和药效两方面的信息。药效信息即化学成分和药效相关性，是通过确定中药复方制剂中的各有效部位(药效实验肯定的化学部分)和其所含的有效成分(各种化合物)间量的比例，从这些比例变化来推算药物的量效关系。多维多息特征谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂面临的保证药效和质量的问题，又为中药研究中缺乏标准物质的问题提供了一种新的解决途径。第三节中药指纹图谱研究程序及技术要求一、指纹图谱的要求（三性要求）中药指纹图谱应满足特征性(专属性或唯一性)、重现性和可操作性的要求。首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。在满足专属性前提下要有较好的重现性，指同一品种的同一样品，同一操作条件下，结果的重现性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱整体特征应有较高的相似度(0.9以上)。具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可用几张指纹图谱来表现某种中药(药材或复方)的各个不同侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应有其特征性。min5101520253035mAU050100150200250300*DAD1,Sig=280.00,2.00Ref=off,EXTofD030