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Southern转膜方法(毛细管虹吸印迹法、电转移法与真空转移法)将凝胶中的DNA进行碱变性并将pH值恢复至中性后,即可将凝胶中的DNA片段转移到固相支持物上。用于转膜的固相支持物有多种,包括硝酸纤维素滤膜(NCM)、尼龙膜、化学活性膜和滤纸等,Southern转膜时可根据需要选择不同的固相支持物用于杂交。常用的Southern转膜方法有以下3种。1.毛细管虹吸印迹法此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用,将凝胶中的DNA转移到固相支持物上,转移方式见图。其原理是:容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠,上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动,同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动,凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。利用毛细管虹吸作用的转移法转移效率不高,尤其对分子量较大的DNA片段更是如此,但由于其器具简单,不需要特殊装置,因此一直被广泛用于Southern印迹的转膜。2.电转移法通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到滤膜上。其基本原理是将尼龙膜与凝胶贴在一起,并将疑胶与尼龙膜一起置于滤纸之间,固定于凝胶支持夹,将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中,凝胶平面与电场方向垂直,附有滤膜的一面朝向正极。在电场的作用下,凝胶中的DNA片段沿与凝胶平面垂直的方向泳动,从凝胶中移出,滞留在滤膜上,形成印迹。电转移法尤其适用于毛细管虹吸法转移不理想的大片段DNA。但应用这种方法需注意不要选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持物;应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液的欧姆热效应;此外,转移缓冲液不能用高盐缓冲液,以免产生强电流破坏DNA。3.真空转移法在真空条件下,DNA和RNA可从凝胶中快速并定量地转移。目前有商品供应的真空转移装置有数种。在这些装置中,硝酸纤维素滤膜或尼龙膜置于真空室上方的多孔屏上,DNA从凝胶中洗膜,并使核酸聚积在滤膜或尼龙膜上。真空转移较之毛细管转移更为有效,而且极为快捷。经碱处理后不完全脱嘌呤和变性的DNA30min内即可从具有正常厚度(4—5mm)和正常琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移。仔细操作,真空转移可以使Southern转移获得的杂交信号增强l~2倍。
本文标题:Southern转膜方法(毛细管虹吸印迹法、电转移法与真空转移法)
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