代谢工程

•第一节微生物工程菌的构建及应用微生物工程菌的构建基因工程在生产生物小分子中的应用第七章基因工程CompanyLogo1.微生物工程菌的构建目的基因表达载体的构建与筛选基因重组转化、筛选和鉴定鸟枪法分离基因基因文库的建立和基因分离基因的化学合成PCR或RT-PCR通过表达载体导入外源基因不带间隔序列利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件连接后形成正确的开放阅读框架利用宿主菌的调控系统非融合型pBV220融合型pGEX系统分泌型pinβ系统DNA连接方式：粘性末端平末端人工接头同聚物加尾影响连接的因素：连接酶的量作用温度与时间底物浓度重组基因导入宿主细胞：氯化钙转化法和电穿孔法转化子的筛选与鉴定：抗药性；a-互补；限制性内切酶酶切图谱；PCR法；核苷酸序列测定等2.基因工程在生产生物小分子中的应用维生素、氨基酸维生素C、苏氨酸、组氨酸、精氨酸、异亮氨酸抗生素头孢菌素C、新霉素、卡那霉素、阿维菌素、•第二节、抗生素合成基因的克隆•（菌株未测序，基因功能不清）•链霉菌的基因组大约8×106bp。第一次成功地利用链霉菌的载体宿主系统克隆到抗生素生物合成基因以来，现已成功克隆到至少50个抗生素生物合成基因。•发现：抗生素的生物合成基因成簇，抗性基因通常是基因簇的一部分；一些相关生物合成途径的基因相互杂交，显示出很强的同源性•优：不需要了解抗生素生物合成途径的遗传信息。1、将目的基因克隆到标准宿主菌中，然后检测个别基因产物抗生素生物合成途径通常涉及到10~30个酶反应骤，如果通过诱变方法使其中的一个酶失活，而使其不能合成最终产物，这种突变株称为阻断突变株。•成功条件：①获得抗生素生物合成途径被阻断的一系列突变株。•②建立以阻断突变株为宿主的载体宿主系统。2、克隆与阻断突变株互补的基因•突变克隆技术是指外源基因借助载体进入抗生素的产生菌中，如果外源基因与抗生素产生菌的生物合成基因有同源性，就有可能与产生菌的转录单位杂交，造成该基因的转录中断而影响其表达，以此确定克隆基因的性质。3、利用突变克隆分析生物合成基因族•对已经克隆到的生物合成基因研究表明，生物合成基因成簇并与抗性基因连锁，为人们提供了这样一种设想：即用敏感菌株（标准菌或产生菌突变株）为宿主，克隆抗性基因•大片段分析与之连锁的生物合成基因•小片段可利用它为探针来克隆同源的DNA片段。4、克隆抗性基因并分析连锁的生物合成基因CompanyLogo•克隆土霉素的抗性基因（OTCr）：•将土霉素产生菌StreptomgcesrimoscesM15883染色体DNA的PstI和BgIII片段分别克隆到载体质粒pRF212和pRF234的PstI和BgIII位点，转化OTCS突变株，筛选后获得了2个OTCr基因（OtrA,OtrB）,以这两个OTCr基因为探针去检测基因库，分别获得了一个阳性菌落，从中分离的DNA片段能与几个土霉素阻断突变株互补。该法克隆到的生物合成基因还包括红霉素，二丙胺磷，嘌呤霉素等。•由于链霉菌DNA中G+C的比例很高，因此链霉菌基因对密码子利用有明显的不随机性，即密码子第三位有90%以上常为G和C。因此在分析某一抗生素生物合成酶的部分氨基酸顺序后，就能设计出较低程度兼并性的寡核苷酸顺序，经人工合成这段顺序后就可用作探针从基因库中钓出所需的克隆子。5、用人工合成的寡核苷酸探测基因库•完整的放线紫红素生物合成基因克隆到一个非产生菌小小链霉菌，结果小小链霉菌产生了放线紫红素。红霉素，土霉素的生物合成基因也用此法克隆成功。6、直接克隆抗生素产生菌DNA大片段到非产生菌中•如用此策略克隆了milbemycin的生物合成基因。首先用actⅢ基因为探针与milbemycin和榴菌素产生菌的基因文库杂交，获得了actIII的同源基因，将这些来自milbemycin和榴菌素产生菌的同源DNA片段转入天蓝色链霉菌的actIII突变株，产生了类似或同样的放线紫红素色素。七、利用已克隆的生物合成基因为探针克隆同源基因CompanyLogo••1、解除限速步骤，提高抗生素产量•控制这种限速步骤的酶基因克隆出来，然后通过合适的载体克隆到原产生菌中，获得限速步骤酶水平的增加而提高产量。•生物合成头霉素C的研究过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸转向次级代谢中间产物，即头霉素C的前体α-氨基己二酸的流通量的赖氨酸ε-氨基转移酶的活力，则必定能提高α-氨基己二酸合成前体的流通量。基于以上设想，摇瓶中的抗生素产量为受体株的5倍。第三节、利用基因工程技术改良微生物药物生产菌种CompanyLogo•结合诱变育种，原生质体融合和基因工程技术对已知抗生素产生菌的遗传操作，以提高有效组份的含量，抑制无效成份的产生，一个最成功的例子是抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建。2、阻断支路代谢，增加有效组份含量••七十年代末在专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白（VHb）。对VHb的功能研究表明，它作为一个氧气携带者，能促进氧气扩散到细胞未端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下也能很好生长。•人们试图从中克隆血红蛋白基因Vgb并研究它对其它微生物生长的影响。研究Vgb基因的导入对重组蛋白表达量和微生物发酵代谢产物产量的影响。•但通过VHb基因的克隆提高抗生素的产量目前可能仅限于那些在发酵中非常好氧而设备条件不能满足其要求的抗生素产生菌。3、引入血红蛋白基因增加抗生素产量•抗生素的产生与菌种对自身抗生素的耐性紧密有关。因此，利用高拷贝质粒的基因量效应，增加菌种对自身抗生素的抗性，有可能增加抗生素的产量。•这一方法可能对低产菌株有效，而对工业高产菌株改良意义不大。•调节基因在抗生素的生物合成中也起很重要作用，增加调节基因的基因量也能大幅度提高抗生素产量。••4、引入抗性基因和调节基因，提高抗生素产量一、代谢工程的产生及沿革二、代谢工程的理论基础三、代谢工程的研究概要四、代谢工程的研究技术与工具五、代谢工程的研究策略六、代谢工程的重要应用和发展前景第八章代谢工程ThefunctionofBacillussubtilisglnAgeneinEscherichiacoliFig.1Resultsofrecombinantstraintransformedproducts(3hand7h)andtheenzymetransformedproducts(15minand30min)基因工程的局限Fig.2CapillaryelectrophoresisresultsofstandardsampleandthetestampleFig.31Hnuclearmagneticresonancespectrumofthetransformedproduct.Fig.4glnAgeneexpressioninthestraincontainingglnAwas238foldshigherthanthatofthestrainwithemptypMD19plasmid.Fig.5.SDS-PAGEoftheproteinexpressionintherecombinantstrainsM.Marker;1.E.coliDH5α;2.E.coliDH5α(pMD19-glnA);3E.coliDH5α(pMD19)一、代谢工程的产生及沿革1半个多世纪微生物生理与育种知识的累积2基因工程理论和技术的成熟3代谢流定量分析技术的发展4生化工程在线检测和建模方法的发展代谢控制发酵代谢流定量分析技术基因工程理论和技术生化工程在线检测和建模方法代谢工程基础微生物生理学、遗传育种学和生物化学的发展，使得人类可以用代谢途径操作的手段来改造微生物以获得期望的性质，如在氨基酸（谷氨酸）、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到采用这个路子实现人类理想的一些突出的例子。代谢控制发酵和育种得以出现和发展。1微生物生理与育种知识的指导半个多世纪微生物生理与育种知识的累积这些方法主要依赖于用化学诱变剂处理微生物，并用进行设计的筛选技术来检出已获得优良性状的突变株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但人们对突变株的遗传和代谢性状的精确变化，知之甚少。但我们已能根据随机诱变后从突变株中筛得的高产突变株遗传标记，及这些突变株的优良性质的实验结果，来推测代谢途径及其控制的机制。这是一种“逆行的代谢工程”（reversemetabolicengineering）。“逆行的代谢工程”为代谢网络的构建和完善，以及代谢工程的进展提供了大量的生理学和遗传学信息。2020/3/129。DNA重组的分子生物学技术的开发和应用，把代谢操作引进了一个新的层面，能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。2基因工程理论和技术的成熟代谢流量分析（metabolicfluxanalysis）是一种研究胞内代谢的方法，根据已有的代谢网络的信息建立胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡，以实际测得的分泌到胞外的代谢中间产物的浓度，来推算代谢流量。3代谢流量分析技术的发展这种分析方法的基础是拟稳态假设，即假设在产物形成速率最大的阶段各种代谢中间物的胞内浓度变化速率为零。根据质量平衡，由n个中间代谢物即可得到n个关于速率的方程，通过测定胞外代谢产物的浓度，计算未知途径的流量。3代谢流定量分析技术的发展色谱、质谱、红外等在线检测手段，以及生物传感技术的发展，可为发酵在线检测和反馈提供可靠的原始数据。建模方法也有发展。4生化工程在线检测和建模方法的发展代谢工程重要事件纪录时间事件意义1956用野生的生物素缺陷型菌株发酵生产谷氨酸代谢控制发酵得以出现和发展1974恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌中引入稳定质粒，提高降解樟脑和萘等有机物能力代谢工程技术的第一应用实例1991发表“TowardaScienceofMetabolicEngineering”，第一次用代谢工程这一术语代谢工程作为一门确定的独立学科发展的转折点1996第一届代谢工程大会，“代谢工程——让细胞为人类工作”报告进一步确立地位和研究方向二、代谢工程的理论基础（一）基本概念（二）代谢工程要解决的问题（三）代谢工程的研究对象、目标与依据（四）代谢工程的实质（五）代谢工程理论涉及的内容每个微生物细胞都具有能量转换机构，这种机构可把其它形式的能量转换成能被其自身直接使用的能量（如ATP，GTP和储存在膜上的质子运动势ΔP），暂且把它们称为代谢能。在代谢能的直接支撑下，活细胞才能维持其高度有序的状态。（一）基本概念1.微生物细胞能为其自身提供代谢能能量转换机构细胞质膜线粒体内膜电子传递链和ATP酶载体系统跨膜的质子回路能量产生NADH，FADH2一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。2.生化反应途径和代谢途径生化反应途径并不是孤立的，而是按生物化学规律汇成生化反应网络；代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络。3.生化反应网络和代谢网络代谢中间化合物都在代谢网络上，有些外源有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“联网”（把指定的化合物连接到代谢网络上去）。“联网”可以用化学或生物学方法（含DNA重组技术）来实现。已在“网”上或者可以“联网”的化合物都可能被开发为工业发酵的产物或原料。3.代谢网络的联网问题代谢物在代谢网络中流动形成代谢流。广义的代谢流还包括能量流和信息流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指有机物流（碳架物质流）。4.代谢流和碳架物质流在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。5.代谢主流有代谢物流通过的代谢途径即载流途径。在工业发酵的目的产物生产阶段，碳架物质从原料到目的产物流经的各段代谢途径（即载流途径），按流经的先后次序首尾衔接，组合成载流路径。代谢工程需重点研究载流路径上的代谢主流。6.载流途径与载流路径微生物的代谢主流的方向、流量甚至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的选择