“苏云金杆菌”工业发酵生产工艺中试报告

1苏云金杆菌工业发酵生产工艺中试报告衡阳莱德生物药业有限公司（张明剑、张孝秀、陈卫国）2002年6月在湖南师大生命科学院的支持和指导下，本公司于2000年6月至2001年底进行了“苏云金杆菌”液体发酵生产工艺的中试工作。一、中试一开始，我们提出以下三个目标：（1）根据本地资源，筛选出符合“苏云金杆菌”生产的最佳培养基配方。（2）探索“苏云金杆菌”工业液体发酵生产的最佳工艺条件。（3）提高放罐液含量，降低生产成本。围绕实现这三个目标，我们进行了一系列的试验工作。二、试验方法与过程根据试验的三个目标要求，我们对“苏云金杆菌”发酵工艺的关键培养基配方，后处理工艺的过滤、防腐工艺、包装工艺和质检工艺进行了全面的试验。对培养基配方的中试分为两阶段进行，第一阶段为摇瓶试验阶段。我们在湖南师大生命科学院提供一般细菌发酵配方原则的原始配方基础上，对原配方中氮源部分的花生饼粉、玉米浆、碳源部分的糊精、豆油这些本地不易购到的原料，用本地易购到的黄豆饼粉、菜籽饼粉、糠饼粉、蚕蛹粉和玉米粉、红茹淀粉进行取代和调整，在500毫升三角瓶中和摇床上进行发酵，共做了十五个配方的实验（见表一、表二）。第一次做了十二个配方处理的实验，其中十个为种子培养基配方处理，二个为发酵培养基配方处理，每个处理重复三次，每瓶装培养液60毫升。第二次在第一次摇瓶试验的基础上，做了8个配方的试验（其中五个为第一次试验中挑选出2来的配方处理进行重要试验，三个为新增的发酵培养基配方处理）重复三次，每瓶装量为60毫升。培养温度为30℃～34℃，发酵17小时后在无菌室用吸管吸取1毫升发酵液于装有99毫升无菌水的三角瓶中，玻璃珠打碎后用血球计数板在显微镜下检查计数。第二阶段为实罐实验阶段。在摇瓶试验的基础上，筛选出利用本地原材料而发酵液含量高，成本低的配方处理进行种子罐（3000立升）一级发酵和15000立升发酵罐两级发酵。种子罐一级发酵两个配方处理（即处理8#、处理10#），共两罐批，15000立升发酵罐配方采用处理12，共9罐批，种子罐与发酵罐于接种后4小时取样观察，以后每2小时取样一次，用显物镜在油镜下观察其形态变化和用血球计数板测其含菌数，晶体形成，芽孢少量脱落时即可放罐。两级发酵时，种子罐的培养温度为30℃～32℃，发酵罐前期0～12小时温度为30℃～32℃，12小时后为34℃，通气量4小时后逐步加大至1：0.8～1：1，12小时后适当减小。过滤工艺试验目的是：在保证产品质量的前提下，定出最佳过滤方法。分三个处理：即120～14尼龙帆布过滤处理，双层纱布过滤处理和发酵液不过滤作对照。方法是取发酵液样品，稀释100倍，在150倍显微镜下用血球计数板计数，然后将样品用尼龙帆布和双层纱布分别在洁净的玻璃漏斗上过滤，将滤液分别在150倍显微镜下用血球计数板计数，重复三次。分别取滤液10毫升，在离心机上3000转离心5分钟，观离沉淀物体积，取滤液分别用背包式喷雾器作喷雾试验，记录下结果。防腐工艺试验目的：主要是测定加大防腐剂苯甲酸钠至0.5%后对芽孢萌芽的抑制作用。方法是对成品定期取样制片，于显微镜下观察产品芽孢情况和杂菌感染情况。一年后对同一成品用血球计数板计数后，再做平板计数，测定其芽孢活力，重复两次。3包装工艺试验目的是保证产品质量，克服产品由芽孢的沉降引起含量不均匀的缺点。方法是取同一批号产品在空气鼓动情况下包装成品十件，每件取一瓶分别稀释100倍后，在150倍显微镜下用血球计数板计数，记录下结果。并取不同批号的产品3瓶，不摇动情况下分别测其上下层和摇动后测其混合均匀的含量作为对照。质检工艺试验的目的是定出最佳质检方法，要求可靠、迅速、简便、易行。分两个处理：即血球计数板处理和平板培养计数法，十次重复。血球计数板计数方法同前。平板培养采用细菌培养基，将成品稀释10倍，在32℃下恒温培养24小时以后观察计数菌落数。三、结果分析（一）发酵培养基的试验1、摇床试验经两次摇床试验，证明采用黄豆饼粉、菜饼粉代替花生饼粉，用菜油或糠油代替豆油，用淀粉代替糊精是完全可行的。发酵结果证明：含菌数完全可以超过原配方。试验数据详见表一、表二。根据实验数据分析，得出以下结论：（1）种子培养基配方以处理8#、10#为最好。含菌数量高，分别达45亿/毫升和47亿/毫升。（2）发酵配方以处理12、15为最好，含菌分别达80亿/毫升和65.6亿/毫升，经多重比较分析（LSR法）表明，处理12与原配方（处理14）差异极显著（见表三）。（3）各种配方处理试验结果表明（见表一）种子培养原配方（处理1）含菌数均低于处理6、7、8、9、10，发酵培养原配方（处理14）含菌数均低于处理12、13、15、16。4（4）从试验结果看出：配方中含有黄豆饼粉作氮源加豆油的效果最差。处理2即为此配方，从表三所列的多重比较分析（LSR法）结果来看，处理2与处理8#、10#差异显著。在第一次摇床试验中，发现该配方含菌数太低，因只剩下一个摇瓶，故重复做第二次试验，结果仍然是含菌数很低，仅达18.5亿/毫升，从处理1、2、3、4的结果比较中也明显看出这个趋势。（5）在发酵培养配方中加入一定量的葡萄糖，对含菌数的提高有明显的作用，处理12与15的配方差别仅在于处理12加入葡萄糖，而处理15仅是用淀粉加α－淀粉酶代之，处理13与16的配方差别也在此。结果表明：处理12和处理13的含菌数均分别高于处理15和16。2、大罐发酵试验（1）种子罐（3000立升）一级发酵两罐。配方采用处理12和处理13，均获得成功。配方12的含菌数达40亿/毫升，配方13的含菌数为25.5亿/毫升与摇床实验结果吻合。（2）15000立升发酵罐两级实验，种子培养配方采用处理10#，发酵配方采用处理12，9罐批发酵液含菌数平均为31.7亿/毫升。至此，从摇瓶到大罐的发酵工艺配方条件的实验结果来看，种子培养配方以处理10#为好，发酵配方以处理12为好。（二）过滤工艺试验结果见下表：不同方式过滤液含菌数情况样品尼龙帆布120～14双层纱布发酵液（对照）含菌数比对照减少%含菌数比对照减少%Ⅰ1247.8%230%23Ⅱ1265.7%328.6%35Ⅲ1154.2%240%245不同方式过滤沉淀物情况样品（1）样品（2）样品（3）备注毫升数百分比毫升数百分比毫升数百分比未过滤1.414%1.212%被离心沉淀的液体的体积为10毫升双层纱布0.66%0.66%0.66%尼龙帆布0.22%0.22%0.22%从不同方式过滤夜含菌数情况来看：尼龙帆布过滤含菌数降低47.8%～65.7%，不宜采用。双层纱布过滤发酵液含菌数降低0～8.6%，但从沉淀的情况来看，虽然以层纱布过滤沉淀物比尼龙帆的要高，经喷雾实验不堵喷雾器喷头，可以采用，而且双层纱布过滤具有省工、省时、省成本等优点，但唯一缺点是沉淀物产生较多，使用时必须摇动均匀。（三）防腐工艺试验经过对2001年3-4月份生产的苏云金杆菌悬浮剂产品存放一月后、半年后、一年后镜检来看，未发现营养体和大量杂菌，证明0.5%苯甲酸钠的抑制作用是明显的，但产品液体有变成黑色的现象，经计数检查，对芽孢活性无影响。下表是存放一年的2个样品（样品含菌量25亿/毫升）进行平板计数的情况：ⅠⅡ平均血球板计数法272526平板计数法242122.5注：质检工艺试验血球板计数法较平板培养计数法平均偏高6%。样品沉淀物体积处理样品处理6（四）包装工艺试验对在空气鼓动条件下，同一批号产品取样10瓶的检查结果如下：样品12345678910平均标准差含菌数2625232525232224262624.51.43与平均数相差6%2%6%2%2%6%10%2%6%6%0未用空气鼓动上、下含菌数情况表样品取样部位样品（1）样品（2）含菌数与混合液相差%含菌数与混合液相差%上10－56.5%25－34%下2926%417.9%混合液230380从以上两个表看出，采用空气鼓动，各样品的含菌数与平均数的最大百分误差为10%，而不采用空气鼓动最大误差为56.5%。我们认为采用空气鼓动存在一定误差，经分析，标准差为1.43亿/毫升，其中尚包括计数操作误差在内，但这误差比未空气鼓动的误差显著地减少，对质量影响不大。（五）质量检查工艺试验根据对10罐批样进行血球计数板计数与平板计数结果如下：样品12345678910平均标准差血板计数3035242725333523283030平板计数（对照）2932332421303523272928.3比对照±1＋3134300111.72.297经分析，血球计数板计数与平板计数法相比的标准误差为2.29亿/毫升。由上表看出，血球板计数法结果偏高，这可能是由于某些生长不一致的营养体被计数在内，在发酵终止后，这些菌体丧失活力或自溶而使平板计数结果偏低，也有可能由于质检人员的判断误差引起，将某些样品中与孢子囊和芽孢外形相似的物质微粒计数在内，导致计数结果偏高。虽然，血球板计数法结果略偏高，但两者相差幅度不很大，因此，此工艺以血球计数板计数为主，此法快速、简便，也较为准确，并将内控质量指标定为25亿/毫升，解决了计数结果偏高问题，以确保产品的质量，但必须注意经常做平板计数作对照，确保产品质量关。四、问题与讨论“苏云金杆菌”工业发酵工艺中试结果表明，实验室的工艺条件与工业生产的工艺条件有着一定的区别，原料的来源有一定的差别，因而在投入生产前必须对实验室工艺进行完善，以适合当时当地客观条件，此外，还有一些问题值得探讨，现分析如下：1、豆饼粉代替花生饼粉，使产品的含菌数更高，可能是黄豆饼粉含蛋白质与花生饼粉相当，而油脂含量花生饼粉较高，从而影响苏云金杆菌生长发育的缘故。2、豆饼与豆油同时处于同一配方中，将使发酵液含菌量大大降低。原因有待探讨。可能与“苏云金杆菌”需要多种类型的氮源和碳源有关。3、菜籽饼粉作为“苏云金杆菌”发酵培养基的氮源是大有前途的。试验结果表明，菜饼粉的效果虽次于黄豆饼粉，但相对产品质量指标来说（2000iu/μl相当于25亿/毫升）是完全可以使用的，且菜籽饼粉更廉价，本地资源更丰富。4、温度和通气条件对发酵的影响。根据大罐培养试验，培养温度以830-34℃为宜，但温度再高一点，对发酵也无明显影响，如11#-3罐中途上升至38℃，对发酵周期，含菌数均无不良影响，这可能是“苏云金杆菌”均为高温型芽孢杆菌的缘故，能在较高温度下正常生长。根据大量罐批观察生长期通气量以1：0.8－1：1为好。芽孢形成期可减少通气量。5、产品发臭与产气问题。发酵终止及包装后，产品散发恶臭，并伴随着产气，在气温高的条件下（30～36℃）尤其明显。但对这样的产品检查，未发现感染，也未发现“苏云金杆菌”的营养体，说明该过程不是由于“苏云金杆菌”芽孢继续生长和杂菌感染引起的，但可能是由于芽孢脱落阶段或芽孢本身的生理活动引起的。原因不甚明了，需作进一步的研究和试验探讨。6、剂型问题：“苏云金杆菌”质量标准目前已采用的是测晶体蛋白含量为标准，根据这一特点，粉剂将比水剂具有更多的好处，它具有保存期长，运输破损少，包装费用低等优点，是发展的方向。粉剂工艺以采用吸附后干燥为好，但水剂与粉剂的使用效果是否相当，必须经过田间实验后，才能着手粉剂工艺条件的研究。经过多方面的试验，初步摸出“苏云金杆菌”悬浮剂工业发酵的生产工艺，此工艺经批量生产和田间使用，使用效果显著，技术可靠，经济易行，但也存在一些需要改进完善之处。9表一:第一次摇瓶试验各配方含菌量调查表处理原料12345678910111213花生饼粉0.5%0.5%0.5%豆饼粉0.5%0.5%0.5%2%菜饼粉0.5%0.5%0.5%2%糠饼粉0.5%鱼粉0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%蚕蛹粉0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%0.5%豆油0.25%0.25%0.25%0.25%菜油0.25%0.25%0.25%糠油0.25%0.25%0.25%0.3%0.3%葡萄糖0.3%0.3%0.3%0.3%0.3%0