透射电镜常规样品制备流程(精)

透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。2．漂洗：用1MPBSBufferPh7.2冲洗3次，每次15mins。3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。4．漂洗：用1MPBSBufferPh7.2冲洗3次，每次15mins。5．脱水：室温下，丙酮30％－50％－70％－80％－90％每级作用30mins，纯丙酮在作用3次，每次作用30mins。6．渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以二叶龄水稻叶片为例，其渗透流程如下：无水丙酮/包埋剂＝5：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝3：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：3作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：5作用12hours→纯包埋剂作用45℃作用12hours。注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！7．包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12hours，60℃聚合36～48hours。8．超薄切片：超薄切片的切片面积最大不能超过0.5mm×0.3mm，比较难切的植物样品要求切片面积更小。超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超薄切片，却是一件不容易的工作。做好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好的切刀以及操作者的熟练技术等。超薄切片前期需要准备载网和支持膜、修块、制刀等，前期准备工作至少需要半天时间。超薄切片是极其精细、耗费眼力的工作，需要静下心来慢慢操作，切好一个样品至少需要1小时。9．正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程是：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色30分钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：①醋酸铀具有放射性，使用时要特别注意。②柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要现用相配，所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。③由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率有40％，所以每个样品的切片一定要留出铜网作备份。