(讲课)基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序1、目的基因的选择获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤:有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的选择获取:1、目的基因:主要是编码蛋白质的结构基因;也可以是具有调控作用的因子。2、获取目的基因的常用方法有哪些?从基因文库中获取。利用PCR技术扩增；化学方法直接合成。人工合成：从已有的物种中分离：把需要研究的基因称为目的基因。基因工程所述的目的基因：（一）、从基因文库中直接获取：1.什么是基因文库？将某一物种的生物不同的基因许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，由这些含有不同基因片段的受体菌群组成的基因总和称为基因文库。2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一个物种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一个物种生物的部分基因，如：cDNA文库3.如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则：简单的说：就是根据目的基因的有关信息进行分类。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。4.构建基因文库的方法：①直接分离法(鸟枪法)：②反转录法：提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库①.直接分离法(鸟枪法)某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶②反转录法：cDNA的合成流程图解基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小较小较大基因中有无启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以5.如何从基因文库中寻找目的基因：简单的说：根据建立基因文库时的分类索引来寻找。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游不能编码蛋白质可调控遗传信息的表达(调控序列)编码蛋白质(编码序列)原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶是由多个肽链构成的蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合,催化转录形成RNA。与RNA聚合酶结合位点AGGUCACGUCGAGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶RNA聚合酶RNA聚合酶真核细胞的基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图•编码区含有：–能够编码蛋白质的序列(外显子)–不能编码蛋白质的插入序列(内含子)非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工转录前体RNAmRNA加工一个典型的真核细胞基因结构示意图非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345原核细胞基因真核细胞基因相同点不同点原核细胞基因与真核细胞基因的比较都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成。编码区是连续的编码区是间隔的，是不连续的1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（）A、染色体DNAB、线粒体DNAC、总mRNAD、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（）A、某生物的全套基因就是一个基因文库；B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库；C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库；D、含有一个生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库。AC（二）利用PCR技术扩增目的基因：是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。PCR——聚合酶链式反应:PCR技术:PCR扩增仪DNA双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子.原理：前提：原料:过程：高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）PCR技术具体过程：a、高温DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成_________b、低温退火复性（55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、适温延伸（70℃-75℃）：在耐热DNA聚合酶（Taq）的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA。双链DNA链在生物体内双链DNA解链能采用高温吗？PCR(多聚酶链式反应）结果：方式:以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。PCR技术扩增与DNA复制的比较：PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子例、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现；B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成；C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸；D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高。答案；C目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：（3）、化学合成方法：二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2、操作环境：体外操作3、基因表达载体的组成：目的基因；启动子；终止子；标记基因。启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来运载体与基因表达载体等同吗？：1、不同点：⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将外源基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。“运载体”强调它的运载基因功能，只要能运载基因就算是运载体。⑵“基因表达载体”，是指能够运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。它强调的不仅是运输，更重要的是运输后能够使目的基因表达。基因表达载体的构成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。2、相同点：“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的；运载体与基因表达载体都含有复制原点及外源基因。①运载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在运载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。⑤复制原点与启动子：复制原点是DNA复制的固定起始点，启动子是位于结构基因上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA相结合并具有转录起始的特异性。简单的说：一个是DNA复制开始，一个是转录开始。注意：例、科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子（抗虫基因首端），导人棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子（抗虫基因末端），导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。由以上过程推知，基因表达载体应具备的结构是（）A、目的基因、启动子B、目的基因、终止子C、目的基因、启动子、终止子D、目的基因、启动子、终止子、标记基因答案:D例、为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答：①图中基因组文库（填“小于”、“等于”或“大于”）cDNA文库。②B过程需要的酶是；③目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中和为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是。逆转录酶DNDcDNA耐高温三、将目的基因导入受体细胞——转化：（一）转化概念：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌特点及转化原理：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的一段特殊的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法：过程基因枪转化法：它的主要原理是将含目的基因的载体包被（吸附）在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化。（2）基因枪法：（3）花粉管通道法：花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.2、将目的基因导入动物细胞：提纯含目的基因表达载体从母体取卵（受精卵）通过显微注射仪注射基因表达载体对含目的基因的受精卵进行早期体外培养移植母体动物输卵管或子宫内①方法：显微注射法②程序：发育具有新性状动物①原核生物特点：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子。②方法：3、将目的基因导入微生物细胞——吸附转化繁殖快、单细胞、遗传物质少。③条件：缓冲液：Mg2+、ATP辅助因子、DTT（二硫苏糖醇）、血清蛋白。温度：12——160c12---16小时；或7—80c2——3天。受体细胞能用结核杆菌吗？（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因：（1）方法:DNA分子杂交DNA分子杂交：来源不同的两条单链核酸分子,通过碱基