ch02柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝

实验二柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝＆硅胶粘合薄层板的铺制指导老师黄红霞色谱法是分离纯化和鉴定有机物的重要方法之一。色谱法可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。思考题：1、色谱法的基本原理?2、柱色谱与薄层色谱之间有怎样的区别与联系3、如何选择洗脱剂？4、装柱时，应该注意哪些问题？5、色谱柱一般的直径和高度比例是多少?6、柱色谱分为几类?分别用什么作吸附剂?7、常用的三氧化二铝吸附剂分为几种?8、吸附剂在使用前必须如何处理?9、被分离样品的量与吸附剂用量之比是多少?10、洗脱时要注意些什么?柱色谱：1905年俄科学家茨维持首次采用装有碳酸钙的柱子，分离叶绿素获得成功而创立了柱色谱法。分类：常用的有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以硅胶、硅藻土等为支持剂，以吸收大量的液体为固定相。（答1）当加入洗脱剂时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中，不同组分或不同色带就能分别收集，从而达到分离纯化的目的。柱色谱与薄层色谱之间的区别与联系（答2）薄层色谱和柱色谱不同点：固定相的形状和展开剂的移动方向薄层色谱和柱色谱相同点：在分离原理上基本相同。3、柱色谱（柱层析）（1）在薄层色谱的基础上，进行混合物的分离（2）分类：吸附型（Al2O3、硅胶G等作吸附剂）分配型（硅藻土、纤维素等作支持剂）（答6）（3）吸附柱色谱1）吸附剂：一般采用表面积很大，经过活化的多孔性或粉状的固体氧化铝（酸性、中性、碱性）3种（答7）a、用前应纯化并在105-110℃活化0.5h，于烘箱中自然冷却(答8)b、吸附剂用量被分离样品的量与吸附剂用量之比被分离样品：吸附剂量=1：30-40或100倍(答9）2）样品：3）洗脱剂：溶剂的结构与吸附能力的关系化合物的吸附性与它们的极性成正比即极性大吸附力强，后洗脱。洗脱剂的选择（答3）第一，先极性小的，再极性大的可以是单一溶剂，也可是混合溶剂第二，溶剂纯度要高并经干燥过的4）色谱柱的装填分为：干法和湿法两种（今天用湿法）柱高和柱直径之比=7.5：1（答5）常用洗脱剂的极性：石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸装柱时应该注意的问题（答4）装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面．洗脱时应注意：（答10）（1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒。逐渐出现色层带分离。（2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！（3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。（4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。（5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。实验二柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝一、实验目的1.了解柱色谱的分离原理。2．掌握柱色谱法的实验操作技术。二、实验原理甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:甲基橙亚甲基蓝由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同,极性不同,吸附剂对它们的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同,极性小、吸附能力弱、解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实验以中性氧化铝为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。三、仪器和试剂1.仪器锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱2.试剂中性氧化铝、石英砂、乙醇（95%）、甲基橙、亚甲基蓝四、装置图装柱洗脱五、实验步骤装柱：（1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂直固定在铁架台上，关闭活塞(2)填固定相：向柱中加入已经润湿的Al2O3（7gAl2O3+95%乙醇拌匀）至柱体积的1/2（3）用洗耳球敲打柱身使氧化铝装填紧密，打开活塞，用小锥型瓶承接,控制滴速为1滴/秒,装完后在上面加一层石英沙（约5mm）。操作时要注意吸附剂始终不能露出液面。实验步骤（续）加样：当乙醇液面刚好流至石英砂平面相切时，立刻关闭活塞，向柱内滴加10滴甲基橙和亚甲基蓝的混合物（乙醇溶液），打开活塞。洗脱：待液面降至石英砂层时用少量95%乙醇洗下附在管壁的色素（少量多次），然后用95%乙醇作为洗脱剂，控制流速（约为1滴/秒），当亚甲基蓝色带洗出时，更换锥形瓶收集洗脱液，直至洗脱液无色。更换锥形瓶，并改用蒸馏水继续洗脱，用另外的锥形瓶收集，直到甲基橙全部被洗脱下来。六、注意事项1、吸附剂的选择和活化2、洗脱剂的选择：对未知样品先用极性小的溶剂洗脱，再用极性大的溶剂洗脱3、装柱的技术：松紧度4、吸附剂的用量：5、柱高：柱子太高洗脱慢思考题（1）装柱不均匀或有气泡，裂缝，将会造成什么后果？如何避免？（2）极性大的组分为什么要用极性较大的溶剂洗脱？（3）在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？和和完！硅胶粘合薄层板的铺制薄层色谱基本原理薄层色谱（ThinLayerChromatography）常用TLC表示，它是将固定相均匀地涂在薄板（如玻璃板）上，依靠毛细作用力或重力，使流动相通过固定相的一种色谱。特点：快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。试样预处理简单，对试样限制少。载样量比较大，适用于制备。仪器简单，操作方便。分离能力较强。灵敏度较高。薄层色谱法的主要类型和吸附色谱原理吸附薄层色谱法原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。吸附系数不等实现分离。一般极性强的组分K大，Rf值小；极性弱的组分K小，Rf值大。分配薄层色谱法吸附薄层色谱的吸附剂吸附剂硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等硅胶活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。活化：加热至105℃左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高）操作步骤粘合薄层板的铺制：称取羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.75g，加入100ml水中加热使溶解，放冷，放置后取13ml,再分次加入硅胶5g，调成糊状后倒在清洁的玻璃板上，可幌动或转动玻板，使其均匀流布于整块玻板上，而获得均匀的液层。将玻璃平放晾干，然后于110℃活化40分钟，置干燥器中贮存备用。思考题1.薄层色谱的铺板要领是什么？2涂层的均匀度对实验有何影响？