单分子检测技术

单分子检测SingleMoleculesDetection高等分析化学与实验IntroductionHistoryandbackgroundSingleMoleculesDetection(SMD)SMDinmodernchemistryElectrochemicalDetectionFluorescenceSpectroscopyLocalizedSurfacePlasmonResonance(LSPR)Application2!Extremelysmallspace(submicrometertonanometer)Extremelylowconcentration(picomolar,femtomolar10-15,attomolar)Dynamicenvironment(binding,conformationchanging,diffusion)SingleMoleculesDetection定义1.单分子检测技术是检测灵敏度达到分子水平的一系列高灵敏检测技术。2.单分子检测是分析化学家长期以来梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域,达到了分子检测灵敏度的极限,是物质低含量监测技术中最后一个里程碑。特点：检测空间尺度在纳米数量级,检测的分子数目或相关事件一般在几个(次)到几千个(次)的范围。背景我们为什么需要单分子检测？对超灵敏度检测技术的需求！！！例：AIDS的研究未检出≠不存在光学方法,包括表面增强拉曼光谱、共聚焦荧光显微法等扫描探针显微方法,包括扫描隧道显微镜等研究方法1化学方法,包括电化学检测，化学发光检测等单分子检测的研究方法高空间分辨能力；单分子性质和行为的捕获能力；能收集微弱信号并放大检测,并做相应的分析处理以获取可信的信息。单分子电化学检测溶液中分子在两个电极间进行反复循环氧化还原反应,形成回路和可测量的电流,据此可进行SMD.通过使用特制的纳米微电极，将少量待测电活性分子捕获在纳米微电极与基底之间；在扩散作用下，分子穿梭于微电极与基底之间，从而形成电流，通过检测形成的电流从而实现单分子的检测。可以确定半反应电势自由能及反应动力学.单分子电化学检测单分子的电化学检测的两个前提条件:(1)要能独立检测发生在纳米尺度空间的反应变化,实现对有限个数分子的捕获。（使用纳米微电极）(2)需要把反映单分子行为的微弱信号放大到可以检测的程度。单分子电化学检测检测分子：三甲铵甲基二茂铁(Cp2FeTMA+)电解质：NaNO3电极：Pt-Ir微电极，包裹在纳米级厚度的蜡鞘中。基底：导电基底检测方法：扫描电化学显微镜，并采用正反馈工作模式实现信号放大,检测到pA级电流。结果：探针电流呈现离散变化。电流值为0.5pA、1.0pA和0pA的概率大,这3个电流值分别对应着在探测空间中存在1个、2个或0个电活性分子。单分子电化学检测检测分子本身的电荷变化，是一种直接检测；几乎不影响被测对象；适合和其他方法联用优点缺点电极制备复杂，合格率较低；电极不一样，实验结果重现性不好。单分子荧光检测基本原理:在激光照射下,荧光分子从基态到激发态,发射光子回到基态。根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间,可算出单个分子发射的最大光子数为105~106。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约为1%或0.5%~5%,故单个分子仍可被检测到数千光子信号。检出限约为10-13mol/L，应用最广！光谱法；2.荧光寿命法，纳秒级；3.光子爆发量(强度)，分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的光子数不同；4.时间分辨荧光各向异性。单分子荧光检测操作基本无太大难度，易于实现；检测效率比较高；可进行实时监测优点缺点测定生物大分子如蛋白质和核酸需要进行外部标记局域表面等离子体共振检测局域表面等离子体是存在于金属纳米粒子或不连续的金属纳米结构中的电荷密度震荡。局域表面等离子共振是当金属纳米粒子被入射光激发时,因内部自由电子的协同振荡而产生的共振。光与金属纳米颗粒的相互作用过程：激发光携带一定强度的电场自由电子在电场中开始振荡激发电场和电子的振荡形成共振自由电子吸收能量被共振激发自由电子返回基态并释放能量能量形式：热能+发射光子(散射光)局域表面等离子体共振传感器理论上所有的金属、合金、半导体材料都可以做成LSPR传感器，常用金、银、铂等贵金属。LSPR的吸收光谱峰值处的吸收波长取决于材料的微观结构特性，如组成、形状、大小、局域传导率。单分子电化学检测无需标记；无污染、实时、高灵敏度优点缺点纳米颗粒制备复杂；信噪比低；对检测器要求高在生理条件下，探测生物大分子并提供分子结构和功能之间的信息12识别、分类和定量描述单分子对化学反应的途径进行实时监测检测非均匀聚集体中的单个分子单分子检测技术的应用34LOGO