《环境微生物学》实验四 细菌的染色和细菌细胞构造的观察

实验四细菌的染色和细菌细胞构造的观察细菌的染色和细菌细胞构造的观察•目的要求•染色剂和染色的原理•实验材料•实验程序•思考题目的要求•学习微生物涂片•掌握细菌的一般染色发和革兰氏染色•进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术•观察和识别细菌细胞的特殊构造染色剂和染色原理Ⅰ•微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素如：正负离子之间的相互吸引等•染色剂染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。2.碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。3.中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。4.单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb)的染料。染色剂和染色原理Ⅱ微生物染色常用染料如下表：实验材料•涂片染色用的细菌培养物１.大肠杆菌（Escherichiacoli)24h的斜面培养物。２.枯草杆菌（Bacillussubtilis)12—16h的斜面培养物。•载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。•显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。•示范片１.苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的芽孢；２.胶质芽孢杆菌（Bacillusmucillaginosus）的荚膜；３.枯草芽孢杆菌的鞭毛。实验程序Ⅰ（细菌染色的方法和步骤）•细菌染色的方法:•１.单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。２.复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。•染色技术的一般过程涂片干燥固定染色媒染脱色复染水洗干燥镜检实验程序Ⅱ（简单染色的方法和步骤）•简单染色法（一般染色法）１.菌种：牙垢细菌２.涂片３.干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。４固定５.染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。６.水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。７干燥：空气中自然干燥。８镜检：在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。实验程序Ⅲ（革兰氏染色的方法和步骤）•革兰氏（Gram）染色法1.涂片2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。革兰氏染色法•1.涂片固定2.单染—结晶紫染液第一次染色1min3.媒染—碘-碘化钾溶液浸湿30S4.脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱5.复染—红色的藩红染液第二次染色•呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G-）细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G＋）；实验程序Ⅳ（荚膜染色的方法和步骤）•荚膜染色法（示范）：荚膜薄，易变形，因此在涂片过程中不能用加热固定。1.取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂片，自然干燥，自然固定。2.染色：在已自然晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色2min，以20%硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。3.镜检：油镜观察示范片并绘图（菌体红色，荚膜无色）。细菌荚膜和负染色法实验程序Ⅴ（鞭毛染色的方法和步骤）•菌液的制备及涂片：菌种应预先连续传代5—6代。1.接种：先在斜面底部加入0.5—1mL无菌水，取活化的枯草杆菌1—2环菌苔，接种于无菌水中，300C培养15—18h。2.制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与菌种同温的无菌水中，在280C温箱中保温10min。3.鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即可涂片。涂片后自然干燥、固定。•染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。1.先用刚过滤的鞭毛染色液A染7.5—8min左右。2.倾去A液，再加鞭毛染色液B液染3—5min，水洗，自然干燥。３.用Ｃ液石炭酸复红复染２min，水洗、晾干、镜检。•油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图（菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）。TEM=透射电子显微镜思考题•简单染色法中各步骤的注意事项是什么？•要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？实验四结束