4.2-纳米药物载体在肿瘤免疫治疗中的应用

纳米药物载体在肿瘤免疫治疗中的应用1基于免疫调节因子的免疫治疗细胞因子疗法所需的细胞因子，其他疗法中用到抗体都属于免疫调节因子，这些因子有些本来就在机体表达，有些是体内已表达的因子的竞争物或刺激剂。将在这些免疫调节因子注入体内在加强免疫反应的同时不可避免的产生副作用。细胞因子既可以直接诱导肿瘤细胞凋亡来介导抗肿瘤作用，又可以通过调节免疫反应，提高免疫细胞活力，参与免疫细胞生长和分化来提高抗肿瘤能力。但是上述作用相关的细胞因子半衰期短，没有靶向性，容易引起全身的毒副作用，致使细胞因子与化疗相结合进行的免疫治疗效果并不好，所以研究者应用天然或者合成的纳米药物载体进行细胞因子的递送，在利用细胞因子治疗肿瘤中取得了很理想的效果。常用的纳米载体如脂质体、壳聚糖、病毒样粒子、水凝胶等均可以获得这种效果，但是由于细胞因子特异性的缺乏，且无法直接刺激特异性T细胞，因此细胞因子治疗目前并不作为免疫治疗的常用手段，常作为辅助疗法，而应用效果更广泛的是特异性更强，治疗效果更好的抗体介导的免疫治疗。1.1细胞因子疗法：IL-2系统性运用高剂量的IL-2是第一个被批准的肿瘤免疫治疗方法，1992年美国FDA批准其用于黑色素瘤和肾细胞癌。IL-2是一种能够促进活化的T细胞和自然杀伤细胞（NK）生长的细胞因子。然而IL-2也能促进活化的T细胞凋亡。由于IL-2半衰期极短（大约12分）这导致必须使用高剂量以达到充足的药物作用时间。高剂量的应用导致剂量相关的毒副作用包括血管渗漏综合征（vascularleaksyndrome,VLS）和细胞因子释放综合征，大量的组织细胞因子释放以及IL-2免疫刺激引起的炎性反应严重时甚至能够致命。基于以上原因D.H.Charych等发明了一种包含IL-2的免疫治疗药物前体，NKTR-214，他们利用可解离的PEG连接IL-2。在注射早期阻止IL-2分子同高亲和力的IL-2Rα相结合。当NKTR-214聚集到肿瘤部位时，肿瘤局部的酸性环境使PEG解离，这时IL-2释放出来作用于肿瘤微环境中的免疫细胞。在小鼠B16-F10模型中，NKTR-214同可溶性IL-2相比使肿瘤局部浸润IL-2的浓度提高了500倍。这种细胞因子药物前体同可溶性IL-2相比，在小鼠和非人灵长类动物中的耐受性都很好，在最大耐受剂量没有发现血管泄露综合症。1.2免疫检测点阻断剂在所有的肿瘤研究中，真正为肿瘤免疫治疗带来突破的是近期叫做免疫检查点阻断的临床研究，即用抗体阻断宿主T细胞对肿瘤反应的阴性调节信号（常用的免疫检查点阻断剂及其原理如图2）。两个研究较好的检查点，细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性死亡受体1（PD-1），均表达于T细胞，分别在T细胞早期活化和外周弥散T活化时减弱免疫反应。当T细胞受体（TCR）同APC细胞的抗原肽-MHC分子结合并且T细胞表面的共受体同APC表面共配体结合（例如T细胞表面的CD28同APC表面的CD80、86结合）时T细胞活化。在T细胞活化早期CTLA-4表达上调，因为是CD28的高度亲和类似物，CTLA-4同CD28的配体竞争性结合CD28从而阻断新活化的T细胞的共刺激信号，减弱免疫反应。用抗CTLA-4的单克隆抗体可以解除CTLA-4的抑制作用，但仅限于活化的T细胞。CTLA-4也高表达于调节性T细胞（Tregs）；因此在小鼠中应用抗CTLA-4抗体显示在肿瘤微环境中Tregs显著减少。图2常用的免疫检查点阻断剂及其原理同CTLA-4相比，PD-1主要表达于外周和肿瘤微环境中的T细胞。同其两个配体（PD-L1和PD-L2）中的一个相互作用减弱成熟T细胞的抗原受体信号通路并且降低促炎细胞因子的表达。PD-1表达于T细胞活化阶段及被抗原再次刺激时。阻断PD-1同其配体的相互作用可以在外周短暂的逆转耗竭的T细胞。这些不同的机制已使我们运用抗CTLA-4、PD-1或其配体PD-L1抗体进行免疫治疗。然而，系统使用这些免疫阻断剂启动免疫系统刹车的同时也导致毒副作用，当联合作用时这些毒副作用被放大。使用CTLA-4的单克隆抗体Ipilimumab治疗引起负性事件，主要是免疫相关负性事件（irAEs）。在两个大型的临床研究中，常见的负性事件包括瘙痒（25-35%），腹泻（23-33%），狂躁（15-33%）和疲劳（15-28%）。严重的3级和4级负性事件在20-27%的患者中出现。分析其机制主要是调节性T细胞的缺失。CTLA-4阻断抗体的IgG2a亚型导致肿瘤部位Tregs缺失，外周CD8+T效应细胞增多，一些其他的亚型使外周Tregs和效应T细胞都增多。Tregs主要维持耐受并限制粘膜相关器官（肺和胃肠道）的淋巴细胞浸润。清除胃肠道的Tregs可能导致上皮淋巴细胞增多和淋巴细胞浸润到固有层，因此导致诸如腹泻等负性事件。在人体中PD-1的阻断抗体同抗CTLA-4抗体相比毒副作用较小，仅有大约15%患者经历严重的负性事件，主要是肺炎。联合应用卡点阻断抗体达到了较好的治疗效果，但是同时也放大了毒副作用。Lei等将CTLA-4以高浓度负载在功能化的多孔硅材料（functionalizedmesoporoussiliic，FMS）上通过纳米载体的作用提供持续定点释放。FMS包裹的抗CTLA-4抗体同等量系统给药的CTLA-4抗体相比诱导更好的治疗效果。另外，改变FMSNPs的合成方法可以改变抗体释放的效率和持久性。Li等利用海藻酸盐水溶胶系统将塞来昔布和抗PD-1抗体定位在局部用于治疗小鼠肿瘤。这种海藻酸盐水溶胶系统显著增加塞来昔布和抗PD-1抗体联合应用的抗肿瘤活性。这些功效同肿瘤局部高浓度的药物相关。利用海藻酸盐水凝胶系统同时传递塞来昔布和抗PD-1抗体显著的增加肿瘤和免疫器官中CD4+IFN-γ和CD8+IFN-γ细胞的比例。同时肿瘤微环境中CD4+FoxP3+Tregs和MDSCs的比例显著降低。1.3免疫共刺激受体激动剂抗体CTLA-4和PD-1代表限制T细胞活化和功能作用的重要抑制受体。这些负性调节受体被一些调控T细胞活化的阳性共刺激受体所平衡。传统的例子包括：CD28、CD134（也被叫做OX40或肿瘤坏死因子受体超家族成员4）、CD137（也叫作4-1BB），同负性调节受体一样很多这样的受体已被发现。这些蛋白在APC诱导T细胞活化过程中表达，并且同APC表面表达的受体结合，提供协同刺激T细胞增殖、存活和效应功能的信号。这些受体也表达于其他免疫细胞比如自然杀伤细胞。受体的共刺激作用来自细胞与细胞的相互接触，这些信号也可以通过T细胞表面的共刺激受体被激动剂抗体诱导。这代表另一种免疫调控策略，抗体直接作用于共刺激分子，但是缺点在于产生系统毒副作用。T细胞共刺激分子的激动剂抗体也存在脱靶效应，因为他们的配体也表达于非肿瘤特异性T细胞和其他类型的免疫细胞中，比如一些非免疫细胞有时也表达。非肿瘤效应和促炎细胞因子的低表达，在抗CD137抗体和抗CD28抗体使用中已导致剂量限制的毒性。CD137表达于活化的CD8+T细胞表面，也少量的表达于CD4+T细胞、自然杀伤细胞、NKT细胞、调节性T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞表面。另外，发现这个受体也表达于炎症和肿瘤部位脉管系统的血管和上皮细胞。他的天然配体CD137L表达于APC。如上所述，运用CD137L作用于T细胞的CD137增强T细胞活化、产生炎性细胞因子并且使T细胞免于活化诱导的凋亡。由于记忆性T细胞直接识别肿瘤抗原，在小鼠中应用CD137激动剂抗体取得了显著地抗肿瘤效果。尽管抗CD137抗体具有显著的疗效，在小鼠研究中发现抗CD137处理引起造血功能失调和肝功能障碍。主要的副作用包括过多的T细胞浸润到肝脏、肝炎、淋巴细胞减少、血小板减少、脾肿大、肝肿大以及淋巴结病等。其他的副作用（即脱发、鳞状皮肤脱落、AST和ALT水平升高）以全身炎性反应为特征。全身性细胞因子释放综合症即全身释放促炎细胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、I型干扰素也在抗CD137单一疗法的小鼠中观测到。CD8+T细胞产生的TNF-α在脾肿大、淋巴结病、肝肿大和肝炎中起主要作用。实验中产生的这些毒副作用是T细胞和CD137依赖的，因为在Rag-/-和CD137-/-小鼠中这些毒副作用消失。Kwong等将抗CD137抗体和改造的IL-2Fc融合蛋白锚定在PEG化的脂质体上。在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中瘤内注射NPs能够使肿瘤消退；并且避免了等量可溶性免疫治疗带来的致死性炎症，还产生了保护性的抗肿瘤记忆。研究发现在小鼠中起主要抗肿瘤作用的是CD8+T细胞并且TME中Tregs的数量降低。在另一个研究中，Chen等构建了一个携带抗OX-40抗体的生物可降解PLGA-NP。单独的OX-40抗体在I期临床实验中显示较差的活性。但是当把OX-40负载到PLGA-NP后能够诱导CTL增殖，肿瘤抗原特异性细胞毒性，和大量的细胞因子产生。Kosmides等发明了一种联合抗PD-L1和抗4-1BB抗体的右旋糖酐铁纳米颗粒（irondextrannanoparticles）。这个具有双功能的纳米颗粒促使T细胞识别靶向细胞同时封闭抑制性卡点。该颗粒在体外能够诱导具有耗竭表型的T细胞分泌更多的IFN-γ。在小鼠B16黑色素瘤模型中该纳米颗粒使肿瘤生长减慢并且肿瘤引流淋巴结中PD-1表达下降30%。2肿瘤靶向抗体识别肿瘤抗原的抗体也能被用于免疫治疗促进肿瘤细胞死亡。当直接作用于肿瘤时，抗体可以引起免疫系统相关和不相关的宿主反应，包括直接阻断细胞内信号，诱导基于信号传递的凋亡，增强化疗药物的敏感性，抗体介导的细胞毒性，抗体依赖的细胞毒性。许多案例证实最初用于阻断肿瘤受体的信号也可以通过免疫依赖的机制发挥作用。例如，Trastuzumab一个已批准的抗人表皮细胞因子受体2（HER2）单克隆抗体，在乳腺癌患者中使用Trastuzumab可以提高23-35%的总生存期。Trastuzumab结合HER2的胞外部分，可以降低受体二聚化和细胞内信号，增加HER2的细胞吞噬，抑制HER2胞外结构域的脱落。虽然Trastuzumab，具有相当可靠的安全性，但是由于HER2也表达于心肌细胞和心脏干细胞中这将导致毒性。单独用Trastuzumab处理的患者心脏损伤大概8%。靶向HER2的抗体不仅能够直接作用于肿瘤细胞也能够与化疗药物联合作用起到靶向化疗药物的作用。Won等Trastuzumab和阿霉素共同连接到氧化铁纳米颗粒（IONP/DOX-MFNC），不仅起到了成像的作用，而且将化疗药带到肿瘤局部能够更好的杀死肿瘤细胞。同不表达HER2的肿瘤细胞相比，携带Trastuzumab的纳米颗粒能够更好的杀伤HER2+的SK-BR-3细胞。与正常的细胞相比，肿瘤细胞表面经常出现一些表面抗原的变异、过表达、异常表达等，而抗体介导的免疫治疗是利用抗体与肿瘤细胞表面受体特异性结合，引发肿瘤细胞凋亡，或者靶向肿瘤细胞外基质和肿瘤血管，改善肿瘤微环境的抑制性，抑制肿瘤血管新生。目前FDA已经批准了多种治疗性抗体应用于临床，但是这些抗体面临的共同问题是半衰期短，具有免疫原性，在经静脉给药时并不能很好的富集在肿瘤部位。因此，纳米载体应用于改善抗体介导的肿瘤免疫治疗具有良好的前景。目前主要应用一些高分子聚合物载体对抗体进行递送，并在载体表面修饰PEG，实现长循环，纳米载体运输的单克隆抗体可以杀伤肿瘤细胞，打破免疫抑制微环境，提高对肿瘤的靶向性。在此基础上，多种共载抗体和化疗药物的纳米载体被开发出来，在提高化疗药物疗效的基础之上，还能进行免疫治疗，双管齐下，既获得了协同抗肿瘤的效果，又减轻了化疗药物的毒副作用，实现了“1+1＞2”的作用。聚合物胶束，亦可应用于抗体介导的免疫治疗，一方面可以改善疏水药物的溶解性和稳定性，增强药物的靶向性，同时又可以满足抗体在细胞外发挥作用的限制条件，共同发挥抗肿瘤作用。水凝胶载体则可以通过侵入性给药，增加局部药物浓度，减少全身毒性，并可以增加药物的缓释性。用其共同包载抗体和化疗药物可以使二者在