8dHPLC指纹图谱的多指标成分定量方法研究

基于降脂宁调脂抗氧化有效部位HPLC指纹图谱的多指标成分定量方法研究作者：罗文，刘斌，王伟，石任兵，LUOWen，LIUBin，WANGWei，SHIRen-bing作者单位：北京中医药大学中药学院,北京,100102刊名：北京中医药大学学报英文刊名：JOURNALOFBEIJINGUNIVERSITYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE年，卷(期)：2010，33(6)被引用次数：0次参考文献(6条)1.中华人民共和国国家药典委员会中华人民共和国卫生部药品标准:中药成方制剂19972.关建红.薛征.任晋斌降脂宁调脂及抗动脉粥样硬化的研究2001(4)3.梁吉春.石任兵.刘斌银翘散研究方法的新探讨1999(1)4.杨英.刘斌.毕力夫.王伟降脂宁有效部位及其药效组分对脐静脉内皮细胞损伤的保护作用2009(3)5.杨英.刘斌.毕力夫.王伟.其其格.肖世凤降脂宁调血脂及抗脂质过氧化作用的实验研究2009(5)6.石任兵.刘斌.石钺.陆蕴如中药复方化学与创新药物研究2003(6)相似文献(1条)1.学位论文王福刚何首乌体内代谢及降脂宁血清药物化学研究2008第一部分文献研究总结了中药代谢及中药血清药物化学的研究进展，共引用文献101篇。第二部分何首乌药代动力学研究建立了何首乌中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的HPLC含量测定方法，并对3批何首乌提取物及3批二苯乙烯苷部位进行了含量测定。结果2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.114～0.912μg范围内线性关系良好，加样回收率为101.17％，RSD为2.01％。何首乌二苯乙烯苷部位中2，3，5，4'－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量为54.0～55.4％；何首乌提取物中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为5.42～5.86％。建立了Beagle犬血浆中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的HPLC血药浓度测定方法。结果2，3，5，4'．四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.2064～8.256μg·mL-1内线性关系良好，最低定量限为0.2064μg·mL-1，以信噪比(S/N3)测得最低检测限为0.035μg·mL-1，日内、日间精密度及稳定性的RSD均小于10％，平均回收率均在85％以上，稳定性良好。对何首乌二苯乙烯苷部位及何首乌提取物的药代动力学进行了研究。何首乌二苯乙烯苷部位药动学参数表明，2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷体内药动学过程符合二室开放式模型。Beagle犬灌胃何首乌二苯乙烯苷部位2.0，1.5，1.0g·kg-1体重后，AUC0-∞(mg·h·L-1)分别为4.59±0.35、3.50±0.19、2.04±0.02，AUC与给药剂量基本成正相关。tmax为1h，t1/2kα：2h分别为0.26±0.06、0.42±0.05、0.39±0.03h，tmax和t1/2kα的值均比较小，说明SBGC在体内的吸收比较快。t1/2α分别为0.14±0.02、0.10±0.02、0.20±0.02h，说明SBGC在体内的分布比较快；t1/2β分别为0.64±0.15、0.60±0.03、0.56±0.05h，说明SBGC在体内的消除比较快；CL(s)分别为0.16±0.06、0.20±0.07、0.11±0.05L·h-1，说明SBGC在体内的平均滞留时间比较短。Beagle犬灌胃何首乌提取物2.5g·kg-1体重后药动学参数，AUC0-∞(mg·h·L-1)为1.705±0.2451，与灌胃何首乌二苯乙烯苷部位相比较可知，AUC与给药剂量基本成正相关。tmax为0.75h，t1/2ka为0.2357±0.08997h，比灌胃何首乌二苯乙烯苷部位时间更短，说明SBGC吸收更快。t1/2α为0.039±0.002646h，说明SBGC分布更快，t1/2β为0.7873±0.3332h，说明与灌胃何首乌二苯乙烯苷部位消除时间一致。对2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D．葡萄糖苷在Beagle犬体内的代谢产物进行了研究。通过综合分析代谢物的色谱保留行为、电喷雾一级和二级质谱信息，并与对照品比较，根据原型成分2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-β-D-葡萄糖苷的裂解碎片，鉴定出代谢物M1、M2、M3和M4的结构。SBGC分别以3、5、4'位羟基与葡萄糖醛酸结合，形成葡萄糖醛酸结合物M2、M3和M4；SBGC还可同时与一分子葡萄糖和一分子硫酸结合，形成葡萄糖硫酸结合物M1，我们首次在Beagle犬血浆中发现了SBGC的葡萄糖硫酸结合物，即母体成分SBGC上同时结合了一分子葡萄糖和一分子硫酸，提示了中药有效成分体内代谢过程中，Ⅱ相代谢产物中葡萄糖结合物的存在。这一发现丰富了Ⅱ相代谢反应的内容，为研究中药有效成分体内代谢过程开阔了思路。根据药物在肝脏的代谢规律，推测出2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷在体内的代谢途径。第三部分何首乌血清药物化学研究建立了何首乌提取物及二苯乙烯苷部位的HPLC图谱分析方法，并对主要色谱峰进行了指认。确定12个色谱峰为何首乌提取物特征峰，7个色谱峰为何首乌二苯乙烯苷部位特征峰。选择2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰作为参照峰，计算了各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。经与对照品对照，确认保留时间68.5min的峰为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，保留时间为104.7min的峰为大黄素，保留时间为108.7min的峰为大黄素甲醚。进行了何首乌二苯乙烯苷部位及何首乌提取物血中移行成分的研究。通过Beagle犬灌胃何首乌提取物60min后的含药血浆样品图谱与空白血浆HPLC图谱相比较，确认给药后血中出现了14个移行成分，峰3，4，8，10为直接吸收入血的何首乌原型成分，峰1，2，5，6，7，9，11，12，13，14为何首乌提取物的代谢产物。Beagle犬灌胃何首乌二苯乙烯苷部位60min后的含药血浆样品图谱与空白血浆HPLC图谱相比较，确认给药后血中出现了19个移行成分，峰2，3，8，13为直接吸收入血的何首乌二苯乙烯苷部位原型成分，峰1，4，5，6，7，9，10，11，12，14，15，16，17，18，19为何首乌二苯乙烯苷部位的代谢产物。第四部分降脂宁血清药物化学研究建立了降脂宁的HPLC指纹图谱分析方法。精密度、稳定性、重现性的RSD值均小于3％。利用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)》，生成对照指纹图谱，并确定24个色谱峰作为降脂宁的特征峰。根据《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》，选择2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰作为参照峰，计算了各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。进行了降脂宁血中移行成分归属的研究。通过Beagle犬灌胃降脂宁60min后的含药血浆样品图谱与空白血浆HPLC图谱相比较，确认给药后血中出现了24个移行成分，峰2，5，7，9，18，19，20，24为直接吸收入血的降脂宁原型成分，峰1，3，4，6，8，10，11，12，13，14，15，16，17，21，22，23为降脂宁的代谢产物。通过研究降脂宁供试品溶液及各单味药供试品的HPLC色谱图，比较确定峰2，5，7和9为山楂所含成分直接入血而形成，峰18为何首乌所含成分直接入血而形成，经与标准品对照确定为2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，峰19，20，24为决明子所含成分直接入血而形成，未发现来源于荷叶的原型成分。通过研究Beagle犬灌胃降脂宁及各单味药的含药血浆样品以及空白血浆样品的HPLC色谱图，比较确定峰10和15为何首乌的代谢产物；峰8，11，12，16，17为荷叶的代谢产物；峰21，23为决明子的代谢产物，未发现来源于山楂的代谢产物。进行了降脂宁药效物质基础的研究。通过研究Beagle犬灌胃降脂宁不同时间后的含药血浆样品HPLC图谱，结合血清药理学研究结果，从而确定降脂宁的主要药效物质基础为峰1和峰2。通过比较Beagle犬灌胃降脂宁及各单味药的含药血浆样品以及空白血浆样品的HPLC图谱，比较确定降脂宁药效物质基础峰1和峰2来源于荷叶。将荷叶分离制成不同的部位，分别给Beagle犬灌胃。取含药血浆样品，在同一色谱条件下进行HPLC分析，建立HPLC色谱图，根据保留时间和紫外光谱图，比较确定降脂宁药效物质基础来源于荷叶的生物碱部位。第五部分　总结与讨论对各部分实验结果进行分析讨论，同时阐明了本论文的主要创新点：1.首次采用LC/MSn技术对Beagle犬灌胃2,3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷后血浆中的代谢产物进行定性分析，鉴定出母体成分2,3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和4种代谢物M1、M2、M3和M4。2.首次建立了Beagle犬血浆中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷HPLC测定方法。3.首次采用HPLC法对Beagle犬血浆中2,3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的药代动力学进行研究，初步阐明其药代动力学特征。4.首次对Beagle犬灌胃降脂宁后血中移行成分进行研究，初步阐明其血中移行成分、代谢产物，并进行归属。5.首次进行了降脂宁药效物质基础的研究，最终确定降脂宁主要药效物质基础来源于荷叶的生物碱部位。本文链接：授权使用：万方100元会员卡(WFFOH22272)，授权号：721b6ce2-adcc-4a7e-aa2f-9e03011dff8e下载时间：2010年10月2日