醋纤电泳

1.概述电泳——带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis)。电泳技术2.1按其支持物的物理性状不同可分为：2.1.1滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸纤维膜、聚胺纤维薄膜。2.1.2凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。2.1.3粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。2.1.4线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。2.电泳的分类2.2按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：2.2.1平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。2.2.2垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。2.2.3垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。2.3按pH的连续性不同，区带电泳可分为：2.3.1连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2.3.2非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳等。3.应用：3.1分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等3.2分析某种物质的纯度及分子量3.3电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析4.4免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力4.影响电泳的因素：4.1电泳介质的pH值：溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值离pI越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢。因此应选择合适的pH，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了使电泳过程溶液pH值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。4.2缓冲液的离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势。溶液的离子强度越高，电动电势越小，则电泳速度越慢，反之，则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2M之间。离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需pH值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。4.3电场强度：电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降温。4.4电渗现象液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+-液相固相电渗流电渗示意图血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳1.学习醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理。2.了解醋酸纤维素薄膜电泳的操作技术。3.掌握电泳分离血清蛋白质的方法。[实验目的要求][实验性质]分析型[实验原理]本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-、γ-球蛋白。见实验指导P20【实验仪器、材料与试剂】•薄膜的准备•电泳槽的准备•点样•电泳•染色•漂洗脱色【实验操作步骤】1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分钟。2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在滤纸上(无光泽面朝上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在膜条一端2-3厘米处轻轻水平地落下并随时提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图虚线处为点样位置3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽的支架上。膜条点样的一端放在负极上。通电，130V,40分钟。4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡1分钟。5．漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗至色带清晰的电泳图谱。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白；2，3，4，5分别为α1-，α2-，β-及γ-球蛋白；6为点样原点[结果]1.白蛋白降低：合成能力不足：肝功能下降。合成原料不足：饥饿，腹泻，肿瘤晚期。去路增加：肾病综合症，严重烧伤，大出血等。消耗过多：糖尿病，甲亢等【临床意义】2.球蛋白增加：感染，多发性骨髓瘤，自身免疫性疾病等。球蛋白降低：皮质功能亢进，免疫缺陷病。3.肝病时：清蛋白含量减少,γ-球蛋白明显升高.4.肾病时：早期：选择性蛋白尿：分子量较小的蛋白质丢失，含量下降。如白蛋白。后期：非选择性蛋白尿：除分子量较小的蛋白质丢失，含量下降外，分子量较大的蛋白质（如γ-球蛋白）也丢失，含量也下降。•取膜时应用镊子夹取。•点样不能超出边缘；不能重复点样；必须与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜。•要求薄膜紧贴沿桥并绷直，中间不能下垂。【注意事项】【思考题】醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白各组分的临床意义。