第8章-微生物菌种的筛选及鉴定

主讲惠明博士第8章食品微生物菌种的筛选及鉴定本节要点食品工业上典型的微生物菌种微生物菌种的分离筛选及鉴定微生物菌种的发酵条件优化一、典型工业微生物菌种细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假丝酵母霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲霉，根霉，木霉，青霉放线菌：单孢菌其他：藻类发酵工业常见常用的细菌Leuconostocmesenteroides肠膜明串珠菌Pediococcuscerevisiae啤酒足细菌Bacillussubtilis枯草芽孢杆菌Acetobacteraceti醋化醋杆菌Lactobacillusdelbrukii德氏乳杆菌Steptococcuslactis乳链球菌Clostridiumacetobutylcum丙酮丁醇梭菌Corynebacterumpekinese北京棒杆菌Brevibacteriumammoniagenes产氨短杆菌常见工业微生物及其产物细菌短杆菌：谷氨酸、肌苷酸枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖大肠杆菌：酰胺酶节杆菌：强的松梭状杆菌：丙酮、丁醇6工业上常用的放线菌及产物链霉菌属Streptomyces生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂诺卡氏菌属Nocardia生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵，处理含氰废水小单孢菌属Micromonospora庆大霉素，Rifamycin孢囊链霉菌属Streptosporanium多霉素放线菌酵母酒精酵母：乙醇甘油酵母：甘油假丝酵母：环烷酸、SCP啤酒酵母：细胞色素、辅酶、酵母片类酵母：脂肪酶阿氏假囊酵母：核黄素脆壁酵母：乳糖酶常见工业微生物及其产物霉菌黑曲霉：柠檬酸、蛋白酶、单宁酶、糖化酶栖土曲霉：蛋白酶根霉：糖化酶、甾体激素、青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶木霉：纤维素酶红曲霉：糖化霉、红曲色素常见工业微生物及其产物霉菌分生孢子SaccharomycescerevisiaeBEERBacillussubtilisB53NATTO工业上对生产菌种的基本要求从自然界中分离目的菌种的原则菌种选育的一般方法二、食品工业微生物菌种的来源112.1对工业微生物菌种的基本要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染杂菌或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）生产特性要符合工艺要求2.2从自然界中分离筛选菌种生产菌株来源1、索取或购买2、自己选育用原有菌株进行遗传改造进行育种诱变育种/基因重组育种向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育从自然界中分离菌种从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选（初筛、复筛）→单株纯种分离→性能考察（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤2.2.1采样从自然界种采集含目的菌的样品1.环境条件对土样本中微生物分布的影响（1）营养环境①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌；②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；⑤油田土：石油分解菌；（2）水分①取离地表5-15cm的土样②含水过多、过少都不理想（3）温度：采样以秋季为好（4）通风（5）酸碱度：细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸2.采样方法（1）去除表层土（2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中3.注意记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎尽快分离2.2.2增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制1、方法（1）控制营养成分①纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种③酒精废水，可以增殖废水利用菌*多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2）控制培养基pH细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸但非目的菌的生长不能被完全抑制（3）控制培养温度30℃左右培养，可培殖嗜温微生物50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株（4）热处理——增殖芽孢细菌样品悬浮液经80℃、10min处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌（5）添加抑制剂10%苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放线菌多粘菌素B：抑制G-细菌青霉素：抑制G+细菌制霉菌素：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌21实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选↓采样（造纸厂）→80℃30min处理文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4d，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型2.2.3纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养1纯种分离的一般方法稀释平板法倾注平板或涂布平板划线法稀释分离涂布平板稀释分离倾注平板划线分离（3）组织培养法适用于分离高等真菌及植物病原菌高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗→置琼脂平板上→培养→长出菌丝体注意：对蔓延性霉菌：①加1%去氧胆酸钠②察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖2、平皿反应快速检出法——定性或半定量（1）纸片培养显色法滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基用接种环接种保湿恒温培养据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量（2）透明圈法根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸钙平板透明圈：产酸酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶以大肠杆菌E.coliATCC80739为指示菌，对枯草芽孢杆菌R21-4进行紫外诱变，筛选得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌R21-15，抗菌蛋白的效价提高58.49%。粗提蛋白对棉花黄、枯萎病菌的抑制作用（3）变色圈法淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈：异淀粉酶无色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶（4）生长圈法工具菌：营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物菌落形态明显不同于目的菌方法：106~107工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育（5）抑制圈适用：抗生素产生菌的选育工具菌：对目的抗生素敏感的微生物例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黄色葡萄球菌方法目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落代谢物积累：用打孔器（6MM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5d，使新产生抗生素积累于小琼脂块中测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序（6）菌落特征从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。35（7）从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素产物分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外分析、X-射线衍射分析、穆斯堡尔谱等）产物的定量分析3、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化还原电位）煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V以下培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh（2）创造无氧环境物理除氧空气置换法：干燥器或厌氧培养罐抽真空76mmHg→充入N2（反复3次）→充入CO210%+H210%+N280%化学除氧H2+O2→H2O(钯作催化剂）GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2和CO2，H2与O2反应生成水厌氧指示剂（3）厌氧分离（培养）技术高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术厌氧手套箱厌氧培养装置2.2.4筛选1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），pH、温度、培养时间等。（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法2、复筛：每株3~5瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，3~5%接种量，培养条件可同初筛分析测定：定量，注意副产物复筛可进行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好的1株初筛和复筛的比较初筛复筛种子斜面菌种液体种子摇瓶每株1瓶每株3-5瓶接种量每瓶一环3—5%取舍情况留下产量较高的10--20%的菌株每次保留10—20%，直至最后3—5株好氧培养452.2.5复筛高产菌株的分类鉴定菌体形态特征分析菌体大小、排列、运动性、产芽孢（孢子）特征、产荚膜？鞭毛、菌丝分枝？染色特征生理生化特征分析碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶反应、药物敏感性遗传特征鉴定1、G+C（mol%)（差异5%可以认为不同种，10%可以认为不同属,2、16srRNA的基因序列（同源性97%认为同种）46举例：产PGA芽孢杆菌的鉴定细胞形态特征菌体大小芽孢形状芽孢着生位置G+或G-等47生理生化特征502.2.6培养工艺条件试验与生产试验1、摇瓶发酵条件培养基组成，初始pH，通风量（装液量），接种量，培养温度…2、小型台式发酵罐发酵工艺条件溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…51培养基配方的获得单因素试验多因素试验（正交试验）回归试验最佳配方的验证整个发酵条件的优化举例碳氮源对Bacillussubtilis发酵产PGA的影响基本发酵培养基：L-Glu20g/L，CTA10g/L，NH4Cl4g/L，MgSO4•7H2O0.5g/L，FeCl3•6H2O0.02g/L，K2HPO41g/L，CaCl2•2H2O0.2g/L，MnSO4•H2O0.05g/L,蒸馏水配制，用NaOH调pH7.4，0.1MPa灭菌20min。基本发酵条件:采用300mL三角瓶，装液量50mL，无菌培养容器封口膜封口，摇瓶转速150rpm，种子液种龄24h，接种量4%，37℃振荡培养96h。初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)枯草芽孢杆菌合成γ-PGA培养基优化的回归试验设计对甘油及柠檬酸添加量的优化(正交组合设计)选择因素:Z1——甘油（g/L）,40～120;Z2——柠檬酸（g/L）,4～20其它发酵条件为：Glu20g/L，(NH4)2SO47g/L，K2HPO4••••3H2O0.7g/L，MgSO4••7H2O0.5g/L，FeCl3•6H2O0.02g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4•H2O0.3g/L，pH6.5，装液量50mL/300mL三角瓶，接种量4%(培养24h种子液)，摇瓶转速150r/min。取三水平，Z1：40，80，120;Z2：4，12，20。作变换：X1=（Z1-80）/40，X2=（Z2-12）/8试验方案及试验结果的分析下表综合对碳源、氮源及无机离子的优化试验，得到优化发酵培养基（二）：L-Glu20g/L，CTA9.864g/L，Glycerol80.36g/L，(NH4)2SO47g/L，MgSO4•7H2O0.5g/L，FeCl3•6H2O0.0224g/L，K2HPO40.8922g/L，CaCl20.0323g/L，MnSO4•H2O0.3g/L,蒸馏水配置