方法学评价试验——重复性试验(TP)

方法学评价试验---重复性试验方法学评价试验——重复性试验实验目的与要求掌握：批内精密度评价的基本原理、实验步骤及统计方法。熟悉：重复性实验的注意事项和评价标准。了解：批间、日内及日间重复性实验的区别什么是方法学评价方法学评价（evalutionofmethodology）是通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分析性能的重要手段。其基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密度与不准确度，不论精密度还是准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。方法学评价试验---重复性试验方法学评价常用技术性能指标准确度(accuracy)是指测定值与真值之间的符合程度，由于真值实际上也是一个近似值，所以准确度往往用不准确度来表示。精密度(precision)是指在重复性条件下对同一标本进行多次测定时，各测定值之间随机误差的大小。精密度常用标准差(s)或变异系数(CV%)来表示。方法学评价试验---重复性试验方法学评价常用技术性能指标灵敏度(sensitivity)是指检测系统可检测出的最低分析物浓度，或称检测限。特异度(specificity，SPE)，又称真阴性率(truenegativerate，TNR)，即实际无病按该诊断标准被正确地判为无病的百分比。它反映筛检试验确定非病人的能力。方法学评价试验---重复性试验方法学评价常用技术性能指标分析测量范围(analysismeasurerange，AMR)是指对没有进行任何预处理（稀释、浓缩等）的标本，分析方法能够直接测定出的待测物的范围，也就是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，即线性范围。临床可报告范围(clinicalreportablerange，CRR)，是允许应用样本稀释、浓缩和预处理后，分析方法可测定样本中分析物的可靠范围浓度。CRR是扩展的AMR。方法学评价试验---重复性试验重复性试验重复性试验是在相同条件下，用同一方法、同一试剂和校准品、同一台仪器、在同一实验室由同一人操作对同一标本在尽可能短的时间内进行多次分析测定（一般为20次），以获得批内精密度实验数据。其结果反映各次测定结果间相互接近的程度。其目的在于评价或验证试验方法的随机误差或不精密度。包括批内重复性试验、日内重复性试验和日间重复性试验等。方法学评价试验---重复性试验批内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，在尽可能短的时间内平行测定20次；日内重复性试验是将同一材料分成数份实验标本，在1天内作5轮，每轮4次测定，获得20个测定数据；日间重复性试验是将同一材料分成20份实验标本，每天测定1份，连测20天。分别作统计处理即可测得候选方法的批内、日内和日间的随机误差。方法学评价试验---重复性试验血清(浆)总蛋白(TP)测定血清总蛋白质检测有何临床意义？血清总蛋白质（totalprotein，TP）是血清中各种蛋白质的总称，是血浆固体成分中含量最多的一类物质，具有维持血液正常胶体渗透压和pH、运输多种代谢物、免疫、催化、营养作用等多种功能。90%以上的血清总蛋白由肝脏合成，如清蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原等，当肝脏发生病变时，肝细胞合成蛋白质的功能减退，血浆中蛋白质即会发生质和量的变化。临床上用各种方法检测血浆蛋白的含量来协助诊断肝脏疾患，并作为疗效观察，预后判断的指标。但由于肝功能有很大代偿能力及清蛋白半衰期较长，因此肝脏病变往往达到一定程度和一定病程后才能出现血清总蛋白和清蛋白量的改变。血清(浆)总蛋白(TP)测定血清总蛋白质检测有何临床意义？1．生理性升高：剧烈运动后。2．生理性降低：妊娠。3．病理性升高（相对少见）：(1)血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。常见于急性失水引起血液浓缩(如呕吐、腹泻等)；休克时，毛细血管通透性发生变化，血浆浓缩；慢性肾上腺皮质机能减退的病人，由于钠的丢失继发水分丢失，血浆也发生浓缩。(2)血清蛋白质合成增加(主要是球蛋白的增加)。总蛋白可超过100g／L，多见于多发性骨髓瘤病人。参考区间：65~85g/L血清(浆)总蛋白(TP)测定血清总蛋白质检测有何临床意义？4．病理性降低：(1)血浆中水分增加，血浆被稀释。因各种原因引起的水钠潴留或输注过多的低渗溶液。(2)营养不良或长期消耗性疾病。如严重结核病和恶性肿瘤等。(3)合成障碍。主要是肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白的下降最为显著。(4)蛋白质丢失。大出血时大量血液丢失；肾病时尿液中长期丢失蛋白质；严重烧伤时，大量血浆渗出等。测定原理（特有的结构和性质）重复的肽链结构酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收与某些染料特异结合的能力采用沉淀反应借助浊度或光折射原理测定电泳的迁移率大小血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法化学法凯式定氮法（N）双缩脲法（肽键）酚试剂法（Lowry法）比浊法（沉淀）血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法早期用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。该方法较双缩脲法反应灵敏100倍左右，检测范围最低可达5μg，通常为20~250μg，使用很广泛，但花费时间长（40~60分钟），干扰因素较多(硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸，各种硫醇)，颜色深浅随不同蛋白质变化，较适合单一蛋白质测定。近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。（灵敏度好，费时，操作要严格计时）1883年建立，是经典的蛋白质测定方法。该法结果准确，精密度高，灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮测定，是蛋白质测定的参考方法，但由于操作复杂、费时（8~10h），影响因素较少（主要为非蛋白氮，但可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离），不适用于常规测定，目前多用于蛋白质的定值和校正其他方法。（测定准确，干扰少，费时太长）此法操作简便、准确、重复性好，干扰物质少(硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸)，在10~120g/L浓度范围内成良好的线形关系，批内CV值＜2%。其缺点是灵敏度较低(1~20mg)，不同蛋白质显色相似，但能满足临床要求，是目前临床测定蛋白质的一种首选方法。物理法电泳法紫外分光光度法血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法此法操作简便、快速（5~10分钟），不消耗样品，测定后仍能回收使用，灵敏高，适用于50~100μg测定。但受蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量的影响，干扰因素也较多（各种嘌呤和嘧啶，各种核苷酸，可校正）。故适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质，不适合血清等组成复杂的蛋白质测定，特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。主要有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦电泳、双向电泳等。全自动电泳仪在临床的应用也逐渐增多，条带清晰，分辨效果好，能看到蛋白质全貌，但耗时较长，需要特殊仪器。染料结合法常用染料有氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼等。氨基黑、丽春红常作为血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂糖凝胶电泳的染料。考马斯亮蓝(Bradford)1976年由Bradford建立，该法灵敏度最高（1~5μg），试剂配制简单，检测速度快（5~15分钟）、简便，，干扰因素少(强碱性缓冲液；TritonX100；SDS)，颜色深浅随不同蛋白质变化。适用于要求灵敏度高的微量蛋白质快速定量测定，如尿液、脑脊液等。但有染料粘附比色杯上不易洗脱的缺点。血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法染料结合法邻苯三酚红钼也可用于测定尿液、脑脊液蛋白质含量，既不粘附比色杯,又具有高灵敏度，已有用于自动化分析测定尿液蛋白质的试剂盒。还有测定Alb常用的染料甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲酚绿（BCG）等，目前应用最广的是BCG。此法操作简便，灵敏度高，重复性好，适合自动分析；且球蛋白一般与阴离子染料不结合，无干扰作用。是清蛋白测定的常规方法，应用最广。血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法免疫化学法利用抗原抗体特异反应免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫化学法等血清(浆)总蛋白(TP)测定蛋白质检测方法实验原理蛋白质分子中的肽键在碱性条件下，与Cu2+产生稳定的紫红色络合物。与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与Cu2+的反应相似，故称为双缩脲反应。络合物颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的浓度成正比（与蛋白质分子量及氨基酸成分无关），与同样处理的蛋白质标准液比较，经计算即可求出血清总蛋白质含量。方法学评价试验---重复性试验试剂与器材1.样本：收集无溶血、无脂浊、无传染性疾病、肝肾功能正常的人混合血清。方法学评价试验---重复性试验2．双缩脲试剂3．蛋白标准液4．自动生化分析仪或722型分光光度计，刻度吸管，试管，试管架，微量加样器，恒温水浴箱等硫酸铜2.0mmol/L酒石酸钾钠31.9mmol/L碘化钾30.1mmol/L氢氧化钠600mmol/L酒石酸钾钠可以与Cu2+形成络合物，并维持Cu2+在碱性溶液中的稳定性，避免形成Cu(OH)2沉淀使试剂失效。碘化钾是抗氧化剂，防止Cu2+还原，从而延长试剂的使用寿命。氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。操作步骤血清(浆)总蛋白(TP)测定加入物空白管（B）标准管（S）测定管（U1~20）蒸馏水（μl）20——蛋白标准液（μl）—20—待测血清（μl）——20双缩脲试剂(ml)1.01.01.0混匀，置37℃水浴10min，以空白管调零，用540nm波长比色，读取各管吸光度值(A值)并计算。将以上收集的样本分为20份并进行编号，按下表操作：结果计算方法学评价试验---重复性试验)/()/(血清LgCAALgTPSSU1.根据以下公式求出各个测定管（U1~20）的血清总蛋白的浓度：结果及讨论2.根据以下公式求出均值和标准差s：表示各测定值总和；i=1表示从第1个样本值开始加，加到第n个x值，本实验共20个测定值。方法学评价试验---重复性试验nxxnii1112nxxsniini1结果及讨论3.离群值检验用求得的均值和标准差对20个测定值进行检验，如果其中有一个数据超过X±3S时，该数据为离群值。剔除该数据后补做一个实验数据后重新计算X和s。有两个以上离群值时，重新进行实验，本次实验作废。4.计算CV。方法学评价试验---重复性试验%100xsCV结果及讨论5.如试验求得的血清TP双缩脲试剂法的CV值＜WHO对中等实验室提出的OCV(±3%)标准，即表明实验条件的控制达到最佳条件，试验结果可按OCV%报告。作为方法探讨实验，其变异系数应该＜OCV标准。方法学评价试验---重复性试验结果及讨论6.变异指数得分（VIS）方法学评价试验---重复性试验100/T)（VXXVI＝V×100／CCVV为变异百分数，X为各室测定结果，X为各实验室结果均值（剔除X+3S以外的结果）,T为靶值,VI为变异指数，CCV为选定的变异系数。VIS即变异指数得分。VI＜400时，VIS＝VI；当VI＞40时，VIS＝400,测定结果与靶值完全一样时，VIS＝0方法学评价试验---重复性试验方法学评价试验---重复性试验例如：某次室间质量评价活动中，血清氯的靶值为98mmol/L，实验室A测得结果为101mmol/L，CCV为2.2，该室血清氯检测得分为：V＝(101－98)×100/98＝3.06VI＝3.06×100/2.2＝139此时VI＜400，VIS＝VI＝139。该室即得分的139。一般情况下，VIS只计整数位，并不带正负符号。结果及讨论（二）变异指数得分（VIS）方法学评价试验---重复性试验WHO对发展中国家在国际质量评价中的标准为VIS＜50为优秀；VIS＜100为良好；VIS＜150为及格。我国根据具体情况确定对参加全国质量评价活动的实验室VIS＜80为优良；VIS＜150为及格。一般认为，VIS＞200，表明结果中有临床上不允许的误差，而VIS＝400的测定结果则会造成临床的严重失误，是绝对不许可的。注意事项1．为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本