第四章 植物细胞工程的基本原理和技术基础

第四章植物细胞工程的基本原理和技术基础4.1植物细胞工程的基本原理4.2植物细胞和组织培养所需条件4.3外植体的选择及消毒4.4外植体的切取和培养植物细胞工程的含义：通过细胞、组织、器官培养以及细胞融合等，达到改良品种、快速繁殖或生产生物产品的一种技术。研究内容：细胞工程基本技术细胞、组织、器官培养原生质体培养细胞融合及培养4.1植物细胞工程的基本原理4.1.1植物细胞的全能性1934年，White首次定义为:每个植物活细胞在合适的条件下，都有发育为胚的能力。70年代，扩大了以上定义范围，为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。80年代初，认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植株的那种合成药用成分的能力，即培养细胞的药物生物合成的能力。一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。细胞全能性的绝对性与相对性:不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体；动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心形成层薄壁细胞厚壁细胞(木质化细胞)特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织居间分生组织侧生分生组织薄壁组织(基本组织)厚角组织输导组织厚壁组织。脱分化：具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程称为脱分化。（如根、茎、叶）再分化：是指离体培养物可以由脱分化状态再度分化。包括细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。4.1.2植物激素的调控作用激素在细胞分化中的作用，可能是通过在转录或翻译水平上的调节作用而影响相关基因的表达从而调控细胞分化。但应该注意到，在植物中细胞种类的不同或同一种细胞不同的发育状态，均会影响该种细胞对激素的反应，即靶细胞反应差异，所以试图寻找不同激素在分化中作用的共同模式可能是很困难的。4.2植物细胞和组织培养所需的营养和环境条件4.2.1培养基的组成和配制4.2.2影响植物组织培养的环境条件4.2.1培养基的组成和配制4.2.1.1培养基的基本成分（1）无机成分培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供。微量元素微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。（2）碳源糖在培养基的作用：①为细胞提供合成新物质的碳骨架②为细胞的呼吸代谢提供底物和能量③维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。（3）维生素类维生素类物质在酶系统中有催化功能。硫胺素（VB1）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（VB6）促进根的生长，烟酸（VB3，又称维生素PP）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc），Vc等。（4）植物生长物质植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而植物生长调节剂是外源的调节植物生长发育的物质。无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸类：NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。生长素的生理作用1、促进细胞生长和细胞分裂。2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力。3、形成愈伤组织，促进生根。4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。细胞分裂素是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤。功能：1、促进细胞的分裂和分化2、诱导芽的分化3、促进侧芽的萌发和生长4、抑制衰老控制植物细胞分化：分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件。比例高时——产生芽,比例低时——产生根。赤霉素（GA3）生理作用：1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效。2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。注：不耐热，应采用过滤灭菌加入。脱落酸（ABA）生理作用：1、抑制蛋白质的合成。2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用。3、诱导休眠、促进衰老和脱落。以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用ppm表示1ppm=1mg/L（5）有机附加物①肌醇（环己六醇）肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成②天然有机物一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。③AA类物质绝大多数AA适量时对培养效果都有正象效应。常用的有Gly、Asn、Gln。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。4.2.1.2培养基的种类和配制MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。KM—8P培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。（1）培养基的种类（根据无机盐的浓度）：①高无机盐含量培养基钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS、LS、BL、BM、ER培养基。②高硝态氮培养基硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养基。③中等无机盐含量培养基大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培养基。④低无机盐含量培养基大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。培养基的筛选：1.无机营养成分：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养。豆科多用B5培养基。2、植物生长调节剂：必须进行筛选试验。总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。3、有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。（2）培养基的配制配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度大若干倍的母液。当配制培养基时，只需按预先计算好的量吸取母液稀释即可。母液应保存在冰箱中备用，保存时间不可过长，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能使用。贮备液（母液）的配制：a、方便b、准确（有些成分量太小）培养基的配制步骤：1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000ml/母液浓度（mg/L）。2、移液取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意（1）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。（2）量取母液时，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。3、称取琼脂蔗糖备用4、融化用搪瓷量杯量取600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。5、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。6、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。7、分装溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1L培养基，可分装20～30瓶。8、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。9、培养基的灭菌4.2.2影响植物组织培养的环境条件培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织。4.2.2.1温度培养都是在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温度一般控制在26-28℃。冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培养温度控制在18-22℃或25℃。4.2.2.2光照的影响培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光周期等方面：光周期：黑暗与光照交替的时间光量：光照强度光质：光的波长1、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应例1：黑暗中培养的烟草花药，其胚状体的分化与幼植物的生长，同经光照培养一样的多。例2：短日照敏