第七章微生物的遗传变异和育种

第一节遗传变异的物质基础第二节基因突变和诱变育种第三节基因重组和杂交育种第四节基因工程第五节菌种的衰退、复壮和保藏第七章微生物的遗传变异和育种几个概念遗传(heredity)变异(variation)遗传型(genotype)表型(phenotype)饰变(modification)第一节遗传变异的物质基础三个经典实验转化实验噬菌体的感染实验病毒的拆开和重建实验（一）转化实验实验材料：StreptococcuspneumoniaeStreptococcuspneumoniae的几种形态S型和R型转化实验转化实验从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验（二）噬菌体感染实验实验材料：E.coli噬菌体（三）病毒的拆开和重建实验(TMV和HRV)结论核酸是负载遗传信息的真正物质基础二、遗传物质在细胞中的存在方式(一)细胞水平(二)细胞核水平(三)染色体水平(四)核酸水平(五)基因水平(六)密码子水平(七)核苷酸水平核酸的七个水平遗传物质类型核基因组真核生物的原核生物的核外染色体真核生物的原核生物的细胞质基因线粒体叶绿体等共生生物2um质粒等F因子(F质粒)R因子(R质粒)Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒等有核膜包裹的真核(DNA+组蛋白)无核膜包裹的核区(环状双链DNA)(二)细胞核水平原核生物的质粒1.质粒的定义•指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA(circularcovalentlyclosedDNA)。2.特点超螺旋结构；携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能的基因；某些质粒可与核染色体发生整合或脱离—附加体；当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的质粒消除，如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；具有重组的功能—质粒与质粒间、质粒与染色体之间；有些质粒不表现任何功能—隐蔽性质粒；3.质粒的种类按其复制与核染色体的复制是否同步严紧型质粒(stringentreplicationplasmid)松弛型复制控制质粒(relaxedreplicationplasmid)按其功能接合性质粒：如F质粒抗药性质粒：如R质粒产细菌素的质粒：如Col质粒具有生理功能的质粒：如固氮的mega质粒、降解质粒等产毒质粒：如Ti质粒4.典型质粒简介1）F质粒(Fplasmid)是E.coli等细菌决定性别并有转移功能的质粒。2）R质粒(Rplasmid,resistanceplasmid)3）Col质粒(colplasmid)大肠杆菌素是一类由E.coli某些菌株所产生的细菌素，具有通过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，由Col质粒编码；4）Ti质粒(tumorinducingplasmid)Agrobacteriumtumefaciens（根癌土壤杆菌）从一些双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。•致癌区•冠婴碱合成区•冠婴碱分解区•Ti质粒接合转移区(tra)•毒性区(vir)•DNA复制区(rep)6个功能区：可遗传变异不可遗传变异-----饰变基因突变染色体畸变生物的变异突变基因重组第二节基因突变和诱变育种一、基因突变（genemutation）（一）定义核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传的变化。（二）基因突变的类型基因突变的类型有哪些？哪些突变型是选择性突变株？哪些是非选择性突变株？为什么？举例说明如何筛选抗性突变株？突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型（三）突变率每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；自发突变几率一般在10-6~10-9范围内；突变率为10-9的含义抗性突变是最常见的突变类型；细菌产生抗药性的途径基因突变抗药性质粒的转移生理适应由基因突变引起的抗药性的原因？两种观点：突变的性状与引起突变的原因间呈对应性—抗性突变株的产生是由环境因素诱发出来的，属定向变异；突变是自发产生的，与环境是否存在该物质无关。1.变量试验（fluctuationtest）实验设计者美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；时间：1943年实验材料：对T1噬菌体敏感的大肠杆菌实验目的验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系实验过程103/mL24-36h如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？如何解释得到的实验结果？噬菌体的作用？实验结果讨论突变的发生在时间上是随机的2.涂布试验（Newcombeexperiment）实验设计者1949年纽康布实验材料对T1噬菌体敏感的大肠杆菌采用固体平板培养实验过程突变率的计算接种时每一平皿的细胞数：5×104培养5h后每一平皿的细胞数：5×104×212.3（5100）=2.6×1086个平皿上共发现28个突变菌落突变率=突变的细胞数/增加的细胞总数=28/6×（2.6×108-5×104）=1.8×10-83.平板影印试验（replicaplating）实验设计者1952年，美国的莱德伯格夫妇实验材料E.coliK12实验过程Lederberg的平板培养法（四）突变的特点不对应性自发性稀有性独立性诱变性稳定性可逆性(五)基因突变及其机制突变诱变自发突变基因突变染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位碱基置换移码突变转换颠换缺失添加诱变剂：凡能显著提高突变频率的理化因子；1）碱基置换转换（transition）嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换颠换（transversion）嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换1.诱发突变•直接引起置换的诱变剂•直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；•间接引起置换的诱变剂•通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后引起的变化。如：碱基类似物；诱变剂种类2）移码突变DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；诱变剂种类：•丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙、-氨基丫啶等）和ICR类化合物；3）染色体畸变某些强烈理化因子，如电离辐射（X射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起DNA分子的大片段损伤；染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；染色体数目的变化；染色体的易位转座DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座(因)子IS插入序列(insertionsequence)Tn转座子(transposon)Mu噬菌体(mutatorphage)ababab2.自发突变(spontaneousmutation)1、由背景辐射和环境因素引起；2、由微生物自身有害代谢物引起；3、由DNA复制过程中碱基配对错误引起等。（六）紫外线对DNA的损伤及其修复胞嘧啶水合物胸腺嘧啶二聚体二氢胸腺嘧啶胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚体1.光复活作用PREA-AT=TPREA-AT=TA-AT-TPREUV可见光二聚体解离PRE光激活酶(photoreactivatingenzyme)A-AT-T5‘3‘5‘3‘A-AT-T5‘3‘5‘3‘A-AT=T5‘3‘5‘3‘A-AT=T5‘3‘5‘3‘OHPA-A5‘3‘5‘3‘OHPT=TA-AT-T5‘3‘5‘3‘UV酶I酶II酶III酶IV2.暗修复（切除修复）酶I——核酸内切酶酶II——核酸外切酶酶III——DNA聚合酶酶IV——DNA连接酶（一）自发突变与育种从生产中育种定向培育优良菌株（二）诱变育种二、突变与育种指利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验或生产实践使用。诱变育种的基本环节诱变育种的原则突变株的筛选方法产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选春日霉素产生菌的孢子悬液诱变涂布平板培养2天（29℃）培养4-5天(29℃)生物鉴定板上含供试菌种培养17-18小时(29℃）检查抑菌圈的大小保持合适的温、湿度产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选(1)与筛选营养缺陷型有关的三类培养基基本培养基(minimalmidium，MM)—[-]完全培养基(completemedium,CM)—[+]补充培养基(supplementalmedium,SM)—[A]（2）与营养缺陷型突变有关的菌体野生型(wildtype)—能在[-]中生长营养缺陷型(auxotroph)—能在[+]或[A]生长原养型(prototroph)—能在[-]中生长抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株(出发菌株)诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿逐个检出法影印接种法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法夹层培养法影印接种法营养缺陷型突变株的筛选方法abc[-][+](4)营养缺陷型的筛选举例——枯草杆菌氨基酸缺陷型菌体前培养氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备诱变处理中间培养淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出（使细胞处于对数生长期）（UV照射60s）（调整细胞浓度为108个/ml）（30度CM中振荡过夜培养）（青霉素法）（生长谱法）营养缺陷型突变株的筛选方法无菌水洗下离心清洗后配成菌悬液（107-108/ml）0.1ml[—].[+]上生长的营养缺陷型培养营养缺陷型的鉴定——生长谱法作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律的标记菌种；作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；；营养缺陷型突变株的应用Amestest测定潜在化学治癌物理论依据一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。生物化学统一性法则生物的“三致”（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。基本原理Salmonellatyphimurium的his-菌株在[-]的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。试验步骤：可疑“三致”试样+鼠肝匀浆S.this-[-]吸入滤纸片保温S.this+[-]阳性阴性培养1、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而在添加了0.1%碱水解酵母核酸后，该菌株能生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌株的生长必需物。2、什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请设计一个具体实验方案。3、怎样用实验证明突变是自发产生的，而不是受环境诱导产生的？作业题(generecombination)基因重组的定义两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。重组和杂交的关系重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。一、原核生物的基因重组（一）转化（transformation）1.定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。2.能进行转化的微生物种类Streptococcuspneumoniae；Bacillus；Rhizobium；Pseudomonas；Staphylococcus；Saccharomycescerevisiae；Neurosporacrassa；Aspergillusnige