生物制药 第十六章 细胞生长调节因子与组织制剂

第十六章细胞生长调节因子与组织制剂第一节细胞生长调节因子的概述一、细胞生长调节因子的概念细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。细胞生长因子常称为生长因子，实际上应包括负性细胞生长因子，即细胞生长抑制因子，因此以细胞生长调节因子来表达广义的细胞生长因子。在很多情况下，多种免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导的。在固有性免疫应答及适应性免疫应答过程中，细胞因子表现出重要的功能。二、细胞因子的共同特性共同的特征：1、绝大多数细胞因子是低分子量（15～30kD）的蛋白或糖蛋白。天然的细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞分泌。细胞因子通常以非特异方式发挥作用，即细胞因子对靶细胞作用无抗原特异性，也不受MHC限制。大多数细胞因子都以较高的亲和力和其受体结合，因此，很微量（pM）的细胞因子就可对靶细胞产生显著的生物学作用。细胞因子的分泌是一个短时自限的过程。这是因为，细胞因子的基因多在细胞受到刺激后开始转录，转录出的mRNA在短时工作后即被降解。2、细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。若某种细胞因子的靶细胞也是其产生细胞，则该因子对靶细胞表现出的生物学作用称为自分泌效应；若某种细胞因子的产生细胞和靶细胞非同一细胞，表现出的生物学作用称为旁分泌效应，在高剂量时也作用于远处的靶细胞，表现为内分泌效应。3、一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子。一种细胞因子可对多种靶细胞发生作用，产生多种不同的生物学效应，这种性质称为多效性；几种不同的细胞因子也可对同一种靶细胞发生作用，产生相同或相似的生物学效应，这种性质称为重叠性。一种细胞因子可以抑制另外一种细胞因子的某种生物学作用，表现为拮抗效应；可以增强另一种细胞因子的某种生物学作用，表现为协同效应。众多细胞因子在机体内存在，相互促进或相互抑制，形成十分复杂的细胞因子网络。三细胞因子的分类和生物学活性（一）细胞因子的种类细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子六类。白细胞介素（IL）最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子，后来发现白细胞介素可由其他细胞产生，也可作用于其他细胞。干扰素（IFN）是最先发现的细胞因子，因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称干扰素。根据来源和理化性质，可将干扰素分为α、β和γ三种类型。IFN-α／β主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，也称为Ⅰ型干扰素。IFN-γ主要由活化T细胞和NK细胞产生，也称为Ⅱ型干扰素。肿瘤坏死因子（TNF）一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。肿瘤坏死因子分为TNF-α和TNF-β两种，前者主要由活化的单核-巨噬细胞产生，抗原刺激的T细胞、活化的NK细胞和肥大细胞也分泌TNF-α。TNF-β主要由活化的T细胞产生，又称淋巴毒素。集落刺激因子（CSF）是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。生长因子（GF）是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。多种未以生长因子命名的细胞因子也具有刺激细胞生长的作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子，如IL-2是T细胞的生长因子，TNF是成纤维细胞的生长因子。有些生长因子在一定条件下也可表现对免疫应答的抑制活性，如TGFβ可抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的成熟及巨噬细胞的激活。趋化性细胞因子是一个蛋白质家族，由十余种结构有较大同源性、分子量多为8～10kD的蛋白组成。趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。淋巴细胞趋化蛋白，对淋巴细胞有趋化作用。二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定（－）一般制备方法细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低，主要是通过组织培养获得。动物细胞培养1、基本概念体外培养就是将活的生物体结构成分或者活的微小个体放到体外环境中让共生存和生长的技术。部分培养所培养的生物成分无外乎有两种结构形式，其一是小块组织或称为组织块，其二是将生物组织分散后制成的单个细胞。体外培养分为原代培养和继代培养两大类。从生物体内取出而用于培养的小块组织一般称为外植块（对于动物组织的称谓）、外植体（对于植物材料的称谓）或者简称植块。由组织块分散后制成的单个细胞一般称为分离的细胞或者分散的细胞。无论是外植块还是分散的单个细胞都可以直接用于培养。体外培养可分为植块培养法和分离（散）细胞培养法两大类方法。前者就是将植块直接进行培养，使之在体外条件下存活和生长；而后者就是将细胞悬液用于培养，使分散的细胞在体外条件下存活和生长。体外培养的结果无外乎有两种，一是维持生存，一是发生显著增长。2、动物细胞的形态和生理特点（1）形态动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，而且已不是靠一个细胞包办一切生理活动，各种细胞都有明确的分工。为了适应其功能的需要，细胞的形态也有了相应的变化，我们称这种变化为分化（或称特化）。我们通常将离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型和贴壁非依赖型，前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。在实践中我们还可以看到有些细胞并不严格地依赖支持物，它们既可以贴附于支持物表面生长，但在一定条件下，它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长，我们把这类细胞称之为兼性贴壁细胞。（2）生理特点①细胞的分裂周期长DNA合成期（S期）间期DNA合成前期（G1期）细胞分裂周期DNA合成后期（G2期）分裂期（M期）G1期：DNA聚合酶和RNA的合成。S期：DNA合成期G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化。M期：主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞②细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附，伸展后才能生长增殖。但在无血清培养基内即使加人了这些因子，有些细胞仍不能贴附生长。当前很少有适用于贴壁细胞使用的无血清培养基。当细胞在基质上分裂增殖，每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再增加，该现象又称之谓接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象随之消失，细胞可多层生长。细胞密度也就可大大增加。③正常二倍体细胞的生长寿命是有限的当细胞离体培养开始，我们称为原代培养。以后经传代后，即成为有限细胞系。这时即使培养条件都很理想，大多数细胞也只能生长有限的时间。细胞经若干代传代培养后将逐渐死亡。该时间的长短决定于细胞来源的种族和年龄。当细胞经自然的或人为的因素转化为异倍体后，该细胞即可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。此时细胞的寿命将是无限的，因此更适合工业化生产的需要。④动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对周围环境非常敏感，包括对各种物理化学因素，如渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱。在细胞膜外没有细胞壁保护，仅仅有一层很薄的粘多糖蛋白。细胞膜是由双层脂质分子镶嵌着某些蛋白分子构成的膜，因此一切能影响脂质和蛋白分子变性的因素都会影响动物细胞的存活。⑤动物细胞对培养基的要求高动物细胞对营养的要求很高，它不仅需要12种必需的氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素，以及作为主要碳原的葡萄糖等外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子等才能生长。水水是细胞生命的化学基础,水具有显著的惰性，许多物质溶在水中后不发生化学变化，这也是水的重要性质。1、水的溶剂作用2、水的热稿定性和导热性3、水的其它作用无机盐类在所布细胞中，无机盐都是以离子状态存在的。1、钠离子与氯离子钠离子与氯离子都是与细胞活动密切相关的离子成分。钠离子与氯离子在动物体内的主要作用是参与生物电活动、维持水的平衡、保持渗透压和酸碱平衡。2、钾离子钾在细胞内外的分布也极不平衡，主要分布在细胞内液，在可兴奋细胞，钾离子是形成静息电位的离子基础。细胞内的钾离子对于激活某些酶是必需的。另外，钾离子在调节细胞内环境的酸碱平衡方面也有极重要的意义。3、钙离子虽然细胞内钙离子的含量还不到人体总含量的0.l％，但它的生物功能却非常复杂和异常重要。在细胞外液中，钙离子的重要作用之一是以钙盐的形式构成组织的成分。因而钙离子对于组织内部细胞之间相互粘着起着十分重要的作用。在进行体外分离（散）细胞培养时，若要将组织分散成单细胞悬液，可以通过螯合细胞间钙离子以使之脱离细胞间质细构，从而达到分散细胞的目的。在细胞内，钙离子参与许多重要的细胞生理活动。钙离子是一种第二信使，钙离子本身或与胞浆中钙调节蛋白结合，可调节许多重要的细胞生命活动。4、镁离子镁离子也是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。与ATP的β及γ磷酸根螯合，可以降低ATP的阴离子浓度，使ATP能反复地与蛋白质的特定部位结合。这使得镁离子在蛋白质、核酸、核苷酸、脂类及糖类的合成中以及肌肉收缩中都不可缺少。此外，有多种其它的酶都以镁离子作为其辅助因子。神经肌肉的传导也需要镁离子的参加。5．磷人体内的磷大部分是以磷酸钙化合物的形式存在于骨质内。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少的。6、碳酸盐在维持酸碱平衡方面非常重要。碳酸盐缓冲对是体内最重要的缓冲体系。葡萄糖葡萄糖是细胞的主要营养物质。在葡萄糖分解代谢过程中，释放的能量用以合成ATP，进而为生命活动提供能量。葡萄糖分解可在有氧条件下进行，其反应在线粒体内发生；亦可在无氧条件下进行，其反应在细胞胞浆内发生。维生素维生素在细胞代谢中起调节及控制作用，虽然所需甚微，但为代谢正常进行的，不可缺少。血液里有4个缓冲体系，分别为碳酸盐缓冲对、磷酸盐缓冲对、血红蛋白缓冲对（KHb／HHb）以及血浆蛋白质缓冲对。其中以碳酸盐缓冲体系为多。体液渗透压体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。溶于血浆中的晶体物质构成血浆晶体渗透压，而血浆中的蛋白质则构成血浆胶体渗透压。主要靠水的转移来维持细胞内、外渗透压的相对平衡。在生物学实验使用的各种溶液中，其渗透压在正常血浆渗透压范围内的称为等渗溶液（如0．85％NaCl溶液）。动物细胞培养基大致可以分成3类：天然培养基在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。合成培养基成分明确的化学试剂配制而成。单纯采用这种合成培养基，细胞常常仍不能很好地增殖，甚至细胞都不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量的动物血清，最常用的是添加5％～10%的小牛血清。在杂交瘤细胞的培养中，血清的要求更高，常需用10%～20％的胎牛血清。无血清培养基⑥动物细胞蛋白修饰功能与细菌不同动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行。在游离核糖体上合成的蛋白质都用于细胞质基质内，而在与膜结合的核糖体上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，它们多数为糖蛋白。这些寡糖链，有的在内质网中加接，有的在高尔基体内加接。在内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖，蛋白质的糖基化与细胞的许多生理功能密切相关，如细胞识别、表面受体、胞内消化和外排分泌物等。原核生物由于缺少糙面内质网结构，因此无法对蛋白质迸行糖基化和其他一系列翻译后修饰。综观动物细胞的上述6点生理特点，不难想象，与采用原核细胞相比，采用动物细胞作为宿主细胞生产药品，有它不足的一面，如培养条件要求高、成本贵，产量低等；但也有它优越的一面，即它们多半是分泌在胞外的，收集纯化方便；得到了较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此更与天然的产品一致，更适于临床使用。今后随着动物细胞培养和表达水平的提高，培养基成本的下降，以及动物细胞使用范围的扩大，如人造器官、基因治疗等，由动物细胞带来的产值可能会超过原核细胞。3、生产用动物细胞的要求（1）、什么样的细胞允许用以生产人用的药品。正常组织分离的原代细胞只要是二倍体细胞，二倍体细胞的寿命一般都不会超过50代。取