2.第三章酶剖析

第五章酶(Enzyme)杨怡教授基础医学院生物化学与分子生物学系[e-mail]一、什么是酶(一)酶是由活细胞产生的，对特异底物具有高效催化作用的蛋白质。又称生物催化剂。(二)生物催化剂分为两类酶核酶(脱氧核酶)(三)被酶催化的物质称底物(substrate,S)，催化所生成的物质称产物(product,P)。(一)单体酶：仅具有三级结构的酶。(二)寡聚酶：由多个相同或不同亚基组成的酶。(三)多酶体系：由不同功能的酶聚合形成的多酶复合体。(四)多功能酶或串联酶：具有多种不同催化功能的多酶体系称为多功能酶。二、酶的不同形式一、酶的化学组成(二)结合酶(conjugatedenzyme)，即全酶(一)单纯酶(simpleenzyme)蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)只有蛋白质部分，无辅助因子的酶即单纯酶。第一节酶的化学组成、结构与功能1.辅助因子类型(1)辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。(2)辅基(prostheticgroup)：与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。2.结合酶的酶蛋白与辅助因子协同作用才能发挥催化作用。3.全酶各部分在催化反应中的作用(1)酶蛋白决定反应的特异性。(2)辅助因子决定反应的种类与性质。直接对电子、原子或化学基团进行传递4.金属酶(metalloenzyme)其金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。5.金属激活酶(metal-activatedenzyme)其金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。6.金属离子的作用(1)稳定酶的构象。(2)参与催化反应，传递电子。(3)在酶与底物间起桥梁作用。(4)中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。7.小分子有机化合物的作用反应中起运载体作用，传递电子、质子或其他基团。Ｂ族维生素与辅酶或辅基的关系维生素辅酶或辅基转移的基团维生素B1(硫胺素)焦磷酸硫胺素(TPP)醛基维生素B2(核黄素)黄素单核苷酸(FMN)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氢原子(质子)氢原子(质子)维生素PP(尼克酰胺)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，辅酶Ⅰ)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+，辅酶Ⅱ)氢原子(质子)氢原子(质子)维生素B6(吡哆醛，吡哆胺)磷酸吡哆醛，磷酸吡哆胺氨基泛酸辅酶A酰基生物素生物素二氧化碳叶酸四氢叶酸一碳单位维生素B12钴胺素辅酶类一碳单位二、酶的活性中心1.酶的必须基团：酶蛋白分子中氨基酸残基侧链与酶的活性密切相关的基团。2.酶的活性中心:必须基团在一级结构上可能相距很远，但是通过肽链的折叠在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，与底物特异的结合并将底物转化为产物。3.结合基团：活性中心内识别底物并与之结合，形成酶-底物的过渡态复合物。4.催化基团：影响底物中某些化学键的稳定性，催化底物发生化学反应并将其转变成产物。++底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心(二)同工酶(isoenzyme)1.定义是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1心肌(H4)LDH2心肌(H3M)LDH3肾脏(H2M2)LDH4骨骼肌(HM3)LDH5(M4)乳酸脱氢酶的同工酶2.举例乳酸脱氢酶(LDH1～LDH5)3.临床意义(1)在代谢调节上起着重要的作用。(2)用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征。(3)同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断。(4)同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345第二节酶催化作用的特点(TheCharacteristicofEnzyme-CatalyzedReaction)酶与一般催化剂的共同点是：在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。酶是蛋白质或核酸，又具有一般催化剂所没有的特征。一、高度的催化效率酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶与一般催化剂催化效率的比较底物催化剂反应温度（℃）速度常数苯酰胺H+522.4×10-6OH-538.5×10-6α-胰凝乳蛋白酶2514.9尿素H+627.4×10-7脲酶215.0×106H2O2Fe2+5622过氧化氢酶223.5×107二、高度的特异性酶的特异性(specificity)一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。根据酶对其底物结构选择的严格程度又分为3种类型。(一)绝对特异性(absolutespecificity)一种酶只能作用于一种特定的底物，生成一种特定的产物。脲酶仅水解尿素，对甲基尿素则无反应。(二)相对特异性(relativespecificity)一种酶可作用于一类化合物或一种化学键。脂肪酶不仅水解脂肪，也可水解简单的酯。胰蛋白酶水解由碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）的羧基所形成的肽键。各种蛋白酶对肽键的专一性人体内有多种蛋白激酶，它们均催化底物蛋白质丝氨酸（或苏氨酸）残基上羟基的磷酸化蛋白激酶共有序列蛋白激酶A-X-R-(R/K)-X-(S/T)-X-蛋白激酶C-X-(R/K1-3,X0-2)-(S/T)-(X0-2,R/K1-3)-X蛋白激酶G-X-(R/K)2-3-X-(S/T)-X-Ca2+/钙调素蛋白激酶Ⅱ-X-R-X-X-(S/T)-X-(三)立体结构特异性(stereospecificity)酶对空间构型所具有的特异性要求称为空间异构特异性（stereospecificity）延胡索酸酶仅对延胡索酸(反丁烯二酸)起催化作用，将其加水生成苹果酸，对顺丁烯二酸则无作用HCH3CCOOHOHHCH3COHCOOHABCABCL-乳酸D-乳酸乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶仅催化L-乳酸脱氢生成丙酮酸，而对D-乳酸无作用。（三）反应的调节性1.对酶生成与降解量的调节。2.酶催化活性的调节。3.通过改变底物浓度对酶进行调节等。酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。（四）酶具有不稳定性酶的本质是蛋白质，凡是影响蛋白质生物学活性的因素都能影响酶的活性。二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速度（一）酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能1．活化能是化学反应的能障活化能：指在一定温度下一摩尔底物（substrate）从低自由能的初始态转变成能量较高的过渡态所需要的自由能，即过渡态中间产物比基态底物高出的那部分能量。酶和一般催化剂加速反应的机制都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物酶促反应活化能的改变结合能2．活化能的降低可使反应速率呈指数上升化学反应速率与自由能变化的关系d[S]kBTV==[S]eG*/RTdth[S]代表底物（substrate）浓度kB是玻尔茨曼常数（Boltzmannconstant）（1.3811023JK-1）h是普朗克常数（Planckconstant）（6.6261034J.s）G*代表反应的活化能在标准状态下反应活化能降低1倍，反应速率可提高约5000倍，呈现指数上升。一般讲，酶的催化效率比非催化反应高1051017倍酶底物复合物E+SE+PES酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。（二）酶与底物结合形成中间产物1.诱导契合作用使酶与底物密切结合酶的诱导契合动画羧肽酶的诱导契合模式底物2．形成酶-底物过渡态复合物过程中释放结合能底物与酶的活性中心相互诱导契合形成过渡态化合物，过渡态与酶的活性中心以次级键(氢键、离子键、疏水键)相结合，这一过程是释能反应，所释放的能量称为结合能(bindingenergy)。结合能可以抵消一部分活化能，是酶反应降低活化能的主要能量来源。酶不能使底物形成过渡态，则没有结合能的释放，也就不能催化反应的进行。3．邻近效应和定向排列有利于底物形成过渡态邻近效应（proximityeffect）和定向排列（orientationarrange）将分子间的反应变成类似分子内的反应，使反应速率显著提高。底物B底物A酶酶-底物复合物在疏水环境中进行酶反应有很大的优越性，此现象称为表面效应（surfaceeffect）。酶的活性中心多位于其分子内部的疏水“口袋”中，酶反应在酶分子内部的疏水环境中进行。疏水环境可使底物分子脱溶剂化（desolvation），排除周围大量水分子对酶和底物分子中功能基团的干扰性吸引或排斥，防止二者之间形成水化膜，利于底物和酶分子之间的直接密切接触和相互结合。4.表面效应有利于底物和酶的接触与结合5.酶对底物呈现多元催化酶是两性解离的蛋白质，酶活性中心上有些基团是质子供体（酸），有些是质子接受体（碱）。这些基团在酶活性中心的准确定位有利于质子的转移，这种一般酸-碱催化（generalacid-basecatalysis）可以使反应速率提高102105倍。质子转移反应都包含一般酶-碱催化反应氨基酸残基酸（质子供体）碱（质子接受体）谷氨酸、天冬氨酸RCOOHRCOO赖氨酸、精氨酸半胱氨酸RSHRS组氨酸丝氨酸ROHRO酪氨酸RNHHH+RNH2..CHNHHNCCHR+CHN：HNCCHROHRO-R酶分子中具有酸-碱催化作用的基团酶可与底物形成瞬时共价键很多酶在催化过程中，与底物形成瞬时共价键，底物与酶形成共价键后被激活，并很容易进一步水解形成产物和游离的酶。这种催化机制称为共价催化（covalentcatalysis）。AB+E：AE+BH2OAEA+E：+B酶举例亲核基团共价结合中间产物丝氨酸蛋白酶丝氨酸OH酰基酶巯基酶半胱氨酸SH酰基酶ATP酶天冬氨酸COO磷酰基酶含吡哆醛的酶赖氨酸NH2Schiff碱磷酸甘油酸变位酶组氨酸磷酰基酶谷氨酰胺合成酶酪氨酸OH腺嘌呤酶酶的亲核基团与底物共价结合第三节酶促反应动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。研究一种因素的影响时，其余各因素均为恒定。酶浓度底物浓度pH温度抑制剂激活剂影响因素(influencingfactorofEnzyme-CatalyzedReaction)EEEEEEEEEEEE当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。V[S]一、底物浓度对酶促反应速率的影响呈矩形双曲线表示SaV[S]EEEEEEEEEEEE随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。bV[S]当底物浓度高达极大时反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。EEEEEEEEEEEEc(一)米－曼氏方程式揭示单底物反应的动力学特征中间产物1.酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度Ｋm：米氏常数ＶVmax[S]Km+[S]＝──2.米－曼氏方程式(1)Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比，Vmax=K3[E]，如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数K3。1.Km值Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。2.Km值的意义(1)Km是酶的特征性常数之一。在酶的结构、溶液pH、温度等条件不变的情况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶