化学发光法的原理技术要点及评价应用

化学发光免疫技术第一节发光与化学发光剂第二节发光酶免疫测定（CLEIA）（chemiluminescenceenzymeimmunoasssay）第三节化学发光免疫测定技术(CLIA)（chemiluminescenceimmunoassay）第四章电化学发光免疫测定技术(ECLI)(electrochemiluminescenceimmunoassay)•化学发光免疫技术：集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。概念•特点：特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。化学发光免疫技术的类型•按发光剂不同分为1.发光酶免疫测定（CLEIA）chemiluminescenceenzymeimmunoasssay2.化学发光免疫测定技术(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay3.电化学发光免疫测定技术(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay•按分离方法不同分1.微粒子化学发光免疫测定2.磁颗粒化学发光免疫测定第一节发光与化学发光剂一、发光一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射。1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程。荧光素酶ATP；O2；Mg2+氧化萤火虫荧光素萤火虫荧光素返回光+AMP+O2+CO2+化学发光•机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。•化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。•发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂①能参与化学发光反应；②与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；④应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个条件返回1.酶促反应的发光底物•是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。•CLEIA中常用的酶有HRP和AP•HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸•AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物）•特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物1.1鲁米诺H2O2/OH—HRP+N2+H2O+光对-羟基苯乙酸（HPA）•HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。1.2HPAH2O2HRP+荧光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化二聚体AMPPD•AMPPD在碱性条件下，被AP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2～30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15～60min内光强度保持相对稳定。光AP/OH—HPO42—OOOCH3O-1.3AMPPD4-MUP•4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧光光度计进行测量。荧光AP1.44-MUP4-MU360nm激发光H3PO4+2.直接化学发光剂特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质。反应迅速、背景低、信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光NCH3COORHO+2-NCH3COORONCH3COOO3.电化学发光剂•是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。特点：①反应在电极进行；②电子供体为：三丙胺（TPA）③化学发光剂：三联毗啶钌返回三联毗啶钌分子结构图NNNNNNRuOONOO第二节发光酶免疫测定（CLEIA）一、原理属于酶免疫测定的一种。只是最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。二、技术类型根据酶促反应底物不同可分为：1.荧光酶免疫测定技术2.化学发光酶免疫测定技术根据免疫学反应模式分1.双抗体夹心法和双抗原夹心法3.固相抗原竞争法：荧光酶免疫测定技术反应原理图EEEEE洗涤弃上清EE碱性磷酸酶标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原4MU激发荧光E是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。化学发光酶免疫测定技术反应原理图EEEEE洗涤弃上清EE碱性磷酸酶标记抗体E抗体包被塑料微珠样本抗原AMPPDEAMPPD发光是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。电化学发光原理图•这一过程可在电极表面周而复始地进行•产生许多光子，使光信号增强返回激发态不稳定TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)●333●*基态电极1.抗原抗体结合反应将已包被了抗体的乳胶微粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗体-抗原-酶标抗体复合物技术要点2.分离技术将复合物转移到玻璃纤维上，用缓冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗原-胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。3.酶促发光反应加入4-MUP，酶标抗体上AP将4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激发光的照射下，发出448nm的荧光，经荧光仪记录，放大，根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量1.磁颗粒分离法：用抗原或抗体包被磁颗粒,与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。分离技术2.微粒子捕获法：所用颗粒是无磁性微粒子作为抗体或抗原的包被载体,然后用纤维膜柱子进行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。3.包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离.第三节化学发光免疫测定技术（CLIA）一、原理用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。二、技术类型1.分离方法常用磁颗粒分离技术2.免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶1.抗原抗体结合反应将包被McAb的磁颗粒和待测标本加入到反应管中，标本中待测Ag与磁珠上Ab结合，再加上AE标记Ab，经过温育，形成磁珠Ab-Ag-AE标记Ab复合物。技术要点2.分离技术在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。3.化学发光反应经洗涤的磁珠中，加入H2O2和pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记录1S内所产生的光子能，其积分与被测物含量成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。1.AE其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催化剂。方法评价2.AE与大分子的结合并无减少所产生的光量，从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml。3.AE标记试剂有效期长，可达一年。4.固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更简易、快捷。第四节电化学发光免疫测定技术（ECLI）一、原理是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。二、技术类型1.分离方法常用磁颗粒分离技术2.免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶1.三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本同时加入一个反应杯中孵育反应技术要点2.将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合，将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。3.蠕动泵将形成的[Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。4.蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测Ag的含量。原理图返回抗体包被样本Ru(byp)2+TPA缓冲的磁珠抗原标记抗体液洗涤3方法评价①标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定；②敏感度高，可达pg／ml或pmol水平；③线性范围宽＞104；④反应时间短，20min以内可完成测定；⑤试剂稳定性好，2～5℃可保持一年以上。五、临床应用1.甲状腺激素2.生殖激素3.肾上腺/垂体激素4.贫血因子5.肿瘤标记物6.感染性疾病7.糖尿病8.心血管系统9.病毒标记物10.骨代谢11.过敏性疾病12.治疗药物监测返回