肿瘤分子生物学资料

非病毒性生物载体（化学和物理方法）由于病毒载体是一类外源性的核酸结构材料,且病毒本身存在一些无法解决的问题,故不少研究人员正在努力寻找一些人体本身的生物结构材料来作为人类基因治疗的载体,如人体细胞某些核酸结构材料.非病毒载体广义上讲就是除了病毒载体外的所有基因治疗载体。本质：模仿病毒非病毒载体具有较好的临床应用前景，但需要解决对靶细胞转染的定向性、转染效率低、表达时间短、全身应用及保存不稳定性等问题。在多学科的共同努力，非病毒基因载体的基因治疗将不断降低不良反应，提高疗效。1)裸DNA(nakedDNA)（基因枪，水压法）将目的基因连接在表达质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质介导，是最简单的非病毒载体系统。将质粒直接导入动物组织，诱导动物的免疫系统对所表达的蛋白质产生体液免疫或细胞免疫，即基因疫苗。Nakamura等将荧光素酶基因的裸DNA直接接种到小鼠胃浆膜下，发现该基因能在胃部明显高表达，一次接种后的高表达时间可持续12h之久，其他临近器官则无明显基因表达。肌内注射后可直接诱导相应的免疫反应，也可检测到DNA明显表达。电穿孔(electroporation)技术和微粒子轰击法(microparticlebombardment，即基因枪)的出现，大大提高了裸DNA的转染效率，而且可使DNA直接到达细胞核，避免了各种酶对DNA的降解。Dietrich等采用该方法将白介素12／自介素2基因质粒转染皮下负荷Lewis肺癌的裸鼠，证明能明显减慢肿瘤生长、减少肿瘤转移、延长宿主生存期。2)脂质体和脂质复合物(Liposomeandlipoplexes)脂质体能够介导极性大分子穿透细胞膜，携带DNA进入细胞。脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。它一般都带有一个疏水基团，保证脂质体分散在水介质中时形成脂双层结构，有效保护分子中的疏水部分，将氨基暴露在水介质中，后者通过静电引力与DNA结合并将DNA大分子压缩成可运输的小单元，成三明治状，形成脂质体复合物。增加分子中N+数目以及N+与疏水链的距离即有利于基因转移。阳离子脂质体与DNA形成的复合物颗粒大小从50am到1pm不等；体外细胞试验中大颗粒的转染效率优于小颗粒。物理因素如Zeta电位、粒子大小、DNA／J]旨质体比例和介质离子强度等都影响脂质复合物的稳定性、复合物的形成和转染效率。脂质体DNA复合物局部注射，报告基因仅表达在注射点周围；肝门静脉、动脉血管注射后主要分布在肝脏[5]。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位，如气管内给药可使肺泡上皮细胞中的p半乳糖苷酶基因表达，给予P53凋亡诱导基因可使早期肺肿瘤缩小。使用精蛋白或组蛋白来源的肽压缩DNA后，则DNA被包裹在脂质囊内部，如脂质／鱼精蛋白／DNA复合物，后者是研究的最热门的系统之一。该复合物粒子大小介于100am到250am之间，比传统脂质复合物小3—4倍，介导基因转移的效果优于传统脂质复合物。氯喹可在一定条件下提高阳离子脂质体介导基因传染，因其可提高内吞体的pH而有效抑制内吞体与溶酶体的融合作用，促进复合物从内吞体中释放。联用电穿孔技术或者结合灭活病毒或其肽片段作为膜激动剂能提高复合物进入细胞核的能力。静脉注射脂质体／DNA复合物，对肿瘤部位超声处理可增加肿瘤组织对脂质体／DNA复合物的摄取和表达。3)阳离子多聚物(Polyplex)阳离子聚合物表面的正电荷可与带负电的基因形成带正电荷的复合物，该复合物借静电作用吸附于细胞表面，通过细胞内吞而将基因导入细胞，并获得表达。目前研究较多的阳离子聚合物主要有多肽类：聚赖氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺类：聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺树状物；聚甲基丙烯酸类：聚酰胺型树状物、聚甲基丙烯酸乙酯2一(二甲胺)；天然高分子如壳聚糖、明胶等。这里主要介绍聚乙烯亚胺和壳聚糖。表达也较短暂，给药后14d已不能检出。如果在此聚合物偶联上靶向配体将会增强其转染能力。静脉注射和气管内给药，线形PEI的基因表达量皆优于阳离子脂质体。4)分子偶联体外源DNA或复合物在进入靶细胞后，DNA需要逃避内吞小泡、溶酶体及胞质中核酸酶的降解与破坏。分子偶联体是外源DNA通过共价结合到细胞表面特异受体的配基或单克隆抗体或病毒胞膜蛋白等，利用特异性结合而介导外源基因进入细胞中。Deas等在引入靶向抗体的同时将质粒DNA与组蛋白H。非共价连接，后者作为DNA载体，能降低核酸酶的降解作用，有利于DNA进入细胞核。十．1.EMT：上皮细胞间质转型。Epithelial-mesenchymaltransitions。指上皮细胞会暂时丧失他们的细胞极性，并且表现出具有移行能力的间质细胞特征，成人上皮组织中EMT的异常诱导在肿瘤转移过程中发挥重要作用。是指在一系列特定的细胞外刺激下发生的蛋白质变形和转录改变的集合过程，从而使细胞发生长期的、可逆性改变。1.移植性肿瘤动物模型：指把动物或人的肿瘤移植到同系、同种或异种动物体内，经传代后，它的组织学类型明确，移植成活率、生长速度、自发消退率、宿主荷瘤寿命、侵袭和转移等生物学特性稳定，并能在受体动物中继续传代。1.简述肿瘤转移动物模型的比较医学。①肿瘤转移动物模型按转移过程分为实验性肿瘤转移动物模型和自发性肿瘤转移动物模型；按转移途径可分为血道肿瘤转移动物模型和淋巴道肿瘤转移动物模型；按照移植部位可分为原位移植肿瘤转移动物模型和异位移植肿瘤转移动物模型；按照移植对象可分为同种移植肿瘤转移动物模型和异种移植肿瘤转移动物模型；按照转移程度可分为高转移肿瘤转移动物模型（转移率超过70%）和低转移肿瘤转移动物模型（转移率低于30%）。目前研究最多的是人癌异种移植肿瘤转移裸小鼠模型。②就肿瘤转移的研究而言，自发性转移模型优于实验性转移模型，实验性转移动物模型只是模拟了肿瘤转移的部分阶段，不能体现临床肿瘤转移的全过程。而自发性转移模型较好地重现了临床肿瘤转移的全部过程，是肿瘤防治及转移机理研究的理想模型，但操作复杂，不易观察，而且实验的不稳定因素较多，因而也给该模型的广泛使用带来了较多困难。人体肿瘤模型优于动物源性肿瘤模型，体内模型优于体外模型，体外实验只是反映了转移肿瘤细胞生物学特性的一部分。原位移植高转移动物模型优于皮下移植高转移动物模型。皮下移植高转移动物模型作为经典的移植模型，具有操作简便，易于观察，结果稳定，重复性好等优点，模拟了临床肿瘤转移的全过程，而被研究者广泛使用，但是移植的肿瘤脱离了原来生长的微环境，使得肿瘤的生物学特性不能充分表达，而且能够选择的动物模型并不多。原位移植高转移动物模型弥补了皮下移植的某些不足，与临床实际情况更为相似。③临床上癌的转移以淋巴道转移为主，而肉瘤的转移则以血道转移为主。但是现在已建的肿瘤转移动物模型大多以血道转移为主，只有部分模型伴有淋巴道转移。肿瘤移植性转移动物模型特别是自发性转移动物模型较好地表达了恶性肿瘤包括转移在内的生物学特性，反映了肿瘤生长发展的全过程，但是和通常的移植性模型一样没有表现出肿瘤的发生情况，这有别于自发性肿瘤模型和诱发性肿瘤模型。④人体是一个免疫健全或基本健全的机体，而且动物的体内环境与人的体内环境也不相同，因此人体肿瘤转移免疫缺陷动物模型得出的实验结果只能提供参考，并不能代表临床的实际状况。十一.1.TargetedVectors(Carriers)：靶向载体。靶向药物的载体系统至关重要，应具备的特点：颗粒小，能在循环中通过毛细血管到达靶部位；载体能够较好地负载药物，使药物的载药量足够高，以满足在靶区的治疗浓度；经过外包装的药物在靶位点释放，仍应具有足够的生物学活性；能够定位于靶位点；有足够的循环半衰期以确保到达靶部位；载体的生物相容性好，其降解产物能被机体消除或对机体无害；抗原性小，热源性小，不易形成血栓。2.Enhancedpermeabilityandretentioneffect(EPR)：通透性增强与滞留效应。肿瘤组织由于快速生长的需求，血管生成很快，导致新生血管外膜细胞缺乏、基底膜变形，因而纳米级的嵌段共聚物胶束能穿透肿瘤的毛细血管壁的“缝隙”进入肿瘤组织，而肿瘤组织的淋巴系统回流不完善，造成粒子在肿瘤部位蓄积，这就是EPR效应，在实体瘤中是一种非常典型的现象。1.简述抗癌药物（基因）靶向给药的主要策略。肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病之一，近年来，随着人们对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入，肿瘤基因治疗获得突飞猛进的发展，并逐渐走向成熟，批准进入临床试验的基因治疗药物逐年增多。肿瘤基因治疗原理是将目的基因用基因转移技术导人靶细胞，使其获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，或保护正常细胞免受化学治疗与放射治疗的严重伤害。针对各种肿瘤发生、发展机制，肿瘤基因治疗大致从以下几个方面着手，包括抑制癌基因的表达活性、补偿肿瘤抑制基因的活性、抑制血管生成、免疫基因治疗、自杀基因疗法和肿瘤多药耐药基因治疗等。1.抑制癌基因的表达活性肿瘤基因治疗的一个方法就是抑制原癌基因的异常活化，目前主要采取的策略是抑制原癌基因的转录、翻译及干扰其转运等。在转录方面，利用人工合成的双链或单链DNA寡核苷酸特异性结合于原癌基因的转录起始区，形成三螺旋DNA从而抑制转录。在翻译方面，一是利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达。二是体外人工合成反义寡核苷酸(ODNs)或利用核酶特异性地封闭和切割癌基因的mRNA，从而达到治疗肿瘤的目的。核酶是一特异性RNA分子，能结合并切割特定的mRNA序列，阻断和破坏mRNA的翻译。目前，已不少针对不同基因的核酶在一些肿瘤的治疗中取得一定效果。在原癌基因表达后，还可通过胞内表达的单链抗体与原癌蛋白结合而阻断其致癌功能，目前已采用的胞内抗体基因主要有抗c—erbB一2及周期素E。2恢复抑癌基因活性肿瘤抑制基因编码各种蛋白调节细胞周期，介导DNA损伤修复，这些基因包括p53、p16INK／CDKN2、IL-24、PTEN等。如果这些基因功能受到抑制，则DNA有异常的癌细胞得以扩增，并逃避凋亡。向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，则可逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗目的。3抑制血管生成实体瘤的生长有赖于获得足够的血供以提供营养物质和氧气。抗血管生成基因治疗的目的是干扰血管生成及干扰肿瘤对缺氧的适应。由于肿瘤的血管生成受到血管生长,因子、血管生长抑制因子以及其它因子的共同调控，因此通过阻断促血管生长因子作用或强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。4.免疫基因治疗肿瘤免疫基因治疗是将免疫相关基因导人体细胞，以提高机体免疫系统的抗肿瘤效应。到目前为止，最常用的肿瘤免疫基因治疗的方法是将细胞因子导入体细胞，提供一个合适的微环境，以有利于提高机体的抗肿瘤免疫应答。目前应用的细胞因子主要包括IL一1、IL一2、IL_4、IL-6、IL-7、IL一12、IL．18、INF一1、INF一仪、G—CSF、GM—CSF等，其中一些已进入临床实验，并取得良好效果。另外，将编码肿瘤特异抗原的基因直接注入人体(肿瘤DNA疫苗)，通过其在机体内的异质性表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。5.自杀基因疗法它是将能编码某些药物敏感酶的基因转导入肿瘤细胞，肿瘤细胞产生的这些酶将低毒或无毒的药物前体转化为细胞毒性产物，从而杀伤肿瘤细胞。因这些基因多是由病毒载体转移入靶细胞，故该方法又称为病毒导向的酶解药物前体疗法(VDEPT)。6.肿瘤多药耐药基因治疗骨髓抑制是抗癌化疗药物的主要副作用，因粒细胞减少所致的感染或由于血小板下降引起的出血也是化疗并发症。多药耐药基因(MDR／MRP)编码P一糖蛋白的跨膜蛋白，它有肿瘤药物位点和ATP位点两个结合位点，通过ATP供能可将细胞内药物泵出从而保护正常细胞免受药物损害。通过基因转移技术转移耐药基因到正常器官组织，保护其免受化疗药物的毒性作用，该疗法可以提高化疗效果。目前，肿瘤耐药基因治疗的方案是转入MDR—I基因、DHFR基因、