分子生物学开题报告

分子生物学实验设计报告研究题目：马铃薯Y病毒抗体的制备及其检测应用姓名：学号：专业：2011级植物病理学导师：一、本实验的立项依据1、国内外的研究现状与存在的问题(附上参考文献)；马铃薯Y病毒是马铃薯Y病毒科[1]马铃薯Y病毒属的重要成员，于1931年在马铃薯中首次被发现[2]，从1953年起马铃薯Y病毒在欧洲尤其在马铃薯种植区广泛流行，20世纪70年代该病毒在美洲扩展，20世纪90年代初其在亚洲开始呈上升发展趋势。马铃薯Y病毒在自然条件下以蚜虫非持久性传毒为主，也可通过汁液摩擦、嫁接等方式传播。该病毒可侵染至少34属163种植物，以茄科、藜科和豆科植物受害最重。马铃薯Y病毒侵染烟草后可引起脉坏死、褐脉病、黄斑坏死等症状。是目前我国烟草生产中普遍发生的重要病毒病之一，其引起的产量损失高达25％一45％[3]。目前，全世界范围内已分离出多种马铃薯Y病毒分离物，这些病毒被划分为许多株系。随着生物技术在植物病理学中的应用，马铃薯Y病毒株系的划分逐渐以病毒核苷酸序列的差异为依据[4]，但目前国际上普遍被人们接受的仍然是DeBokx等的株系划分方法[5]。虽然人们对马铃薯Y病毒有了一些认识，且可以利用各种技术（如杂交瘤技术以及噬菌体抗体库技术）制备该病毒抗体以检测马铃薯Y病毒，但为了彻底防治该病毒，人们现今对该病毒的认识及检测技术的研究是远远不够的，还有待进一步提高。[1]R·赫尔·马修斯．植物病毒学[M]．北京：科学出版社，2007：39—40．[2]SNITHKM．Onthecompositenatureofcertainpotatodiseaseofthemosaicgroupasrevealedbytheuseofplanindicatorsandselectivemethodsoftransmission[J]．ProcRSoc(Lond)BidB，1931，109：251-266．[3]谈文，吴元华．烟草病理学[M]．北京：中国农业出版社，2003：153—154．[4]BLANCO-URGOITIB，PONZF。MARTINEZA，eta1．Astraintypecluste-ringofpotatovirusYbasedonthegeneticdistancebetweenisolatescalculatedbyRFLPanalysisoftheamplifiedCPgene[J]．ArchivesofVirology,1996,141：2425—2442．[5]DEBOKXJA，HUTTINCAH．PotatovirusY[z]．Descrip-tionsofPlantViruses，CMI／AAB．1981：242．2、本实验研究的意义。可感染很多植物，如烟草一旦感染了这种病毒，其叶片常产生黄化、花叶或不规则褪绿色斑块、坏死斑等症状，对烟草的经济价值造成严重影响。鉴于马铃薯Y病毒对烟草产业的危害性，对这种病毒进行分离鉴定、检测及深入分子水平的研究已十分重要，本课题旨在制备该病毒的单克隆抗体并建立适当的检测方法，使用单克隆抗体进行检测具有快速、灵敏、准确的优点，并可用于早期防治，对切断感染源和控制该病毒的流行具有重要意义。单克隆抗体具有特异性强、均质性好、可无限量生产等优点，使用该单克隆抗体建立的抗原包被的血清学方法具有准确性强、易标准化和大规模生产等特点，为病毒病的准确鉴定和大量检测提供了可能。二、实验的研究内容、研究目标和拟解决的关键科学问题1、研究内容：用马铃薯Y病毒免疫的鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆，得到能稳定传代并分泌抗马铃薯Y病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，将其注射到提前7-10d打过降值烷的小鼠腹腔内，采集腹水进行纯化，即得到单克隆抗体；用血清学方法检测该单抗对马铃薯Y病毒的特异性测定、灵敏度检测，最后对田间样品进行检测应用。2、研究目标和预期结果：研究目标：制备纯化的抗原及抗体预期结果：通过精心准备以及仔细的实验操作预期可制得较纯的马铃薯Y病毒抗原及抗体，且该抗体可以快速有效地检测出马铃薯Y病毒。3、拟解决的关键科学问题：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，即使很纯的抗原产生的抗体也可能是针对多个抗原决定簇的混合物，甚至针对同一个抗原决定簇的抗体也会由于是多个B淋巴细胞产生的，其免疫球蛋白(Ig)类型及Ig亚类也不可能是一致的。因而，获得匀质、高效，针对特定抗原的抗体一直是免疫学家努力奋斗的目标。三、拟采取的研究方案和技术路线1、拟采取的研究实验方法、实验手段、关键技术；杂交瘤技术：将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，由此产生的杂交瘤细胞具有两种亲本的特性，既具有骨髓瘤细胞迅速分裂繁殖且无限生长的能力，又具有免疫B淋巴细胞携带的遗传信息，能大量分泌特异性抗体。由于每一个免疫淋巴细胞只能分泌针对单一抗原决定簇的特异性抗体，因而免疫细胞经过克隆化成为单克隆细胞系，就能产生大量单一的高纯度的抗体，即单克隆抗体。2、技术路线（l）、动物免疫；（2）、骨髓瘤细胞培养；（3）、细胞融合；（4）、杂交瘤细胞的筛选；（5）、抗体检测：（6）、杂交瘤细胞的克隆；（7）、融合细胞的冻存；（8）、腹水的制备及单克隆抗体的纯化和鉴定四、本项目的特色和创新之处（与国内外类似研究比较）抗体是人或动物机体在抗原刺激下由分化成熟的终末B淋巴细胞产生的一类能与相应的抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。一种抗原物质刺激机体产生相应的抗体，这种抗原只能与相应的抗体相结合发生反应，这就是抗原的特异性。抗体的发现至今已有100多年，常规的抗体是通过收集免疫动物的血清而获得，故又称为抗血清，它是由多个B淋巴细胞分泌产生，也称为多克隆抗体。抗体的应用无疑在生命科学研究中发挥了重大的作用，且至今仍不失其应用价值。但是抗体作为生物探针，其效价的高低及特异性的好坏，将直接影响试验的结果。而高质量的抗体制备不仅受免疫时抗原的注入剂量、免疫注射途径、免疫佐剂、免疫间隔时间、免疫次数、动物种类、动物性别、年龄、体重、健康状况、动物饲养和采血方式等因素的影响，而且与抗体纯化方法及储存条件等也有关。此外，动物血清中存在的针对无关抗原的抗体会影响检测的特异性和灵敏度。抗原分子通常具有多个抗原决定簇，即使很纯的抗原产生的抗体也可能是针对多个抗原决定簇的混合物，甚至针对同一个抗原决定簇的抗体也会由于是多个B淋巴细胞产生的，其免疫球蛋白(Ig)类型及Ig亚类也不可能是一致的。因而，获得匀质、高效，针对特定抗原的抗体一直是免疫学家努力奋斗的目标。本研究采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，该技术可用不纯的抗原制备针对单个抗原决定簇、高度同质而又能保证无限量供应的单克隆抗体。