10氨基酸的薄层层析实验报告

生物化学实验报告姓名：XXX学号：XXXXXX专业年级：临床八年制__组别：第二实验室实验名称(TitleofExperimetn)氨基酸的薄层层析实验日期(DateofExperiment)XX实验地点(LabNo.)第二实验室合作者(Partner)XXX指导老师(Instructor)XXXX总分(TotalScore)教师签名(Signature)批改日期(Date)一、实验预习1.0实验目的掌握薄层层析法的一般原理。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。1.1实验原理1.1.1薄层层析原理：（是色谱分析技术的一种）一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）1.1.2.氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。1.1.3基于相对迁移率Rf值判定混合氨基酸组分层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。即：Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到斑点对应前沿的距离由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。1.2实验材料1.2.1实验样品①0.01/molL丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。②0.01/molL精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。③0.01/molL甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。④混合氨基酸溶液：将0.01/molL丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。（上述溶液已由老师提前制备完成）1.2.2实验试剂①吸附剂：硅胶G(C.P.)。②粘合剂：0.5%羟甲基纤维素钠（CMCNa）：取羟甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，去上清备用。③展开溶剂：按80:10:10（V/V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。④0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。⑤展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混合展开剂和0.1%茚三酮溶液。1.2.3实验主要仪器和器材①层析板（6cm15cm）；②小烧杯；③量筒(10mL)；④小尺子；⑤毛细玻璃管；⑥层析缸；⑦烤箱；⑧天平；⑨药匙。1.3实验步骤1.3.1实验流程1.3.2实验操作步骤步骤操作（1）制版①调浆：利用普通天平，粗称取3g硅胶，加入0.5%羟甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状②涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层③干燥：将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然晾干④活化：70oC烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。（2）点样①标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距1cm。②点样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm。自然晾干后，必要时可再重复点一次。（3）层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，（该实验中超过板长度的23即可）取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。（4）显色放置在烤箱中用85℃下烘干，即可显出各层斑点。（5）数据处理利用小尺子，测量各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离制版点样层析显色处理与结果分析和溶液前缘至样品原点中心的距离。计算RF值，从而判断混合液的成分组成。1.3.3注意事项①吸附剂：实际实验要求不高，学生不用考虑。②点样：点样的次数依照样品的溶液的浓度而定，样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。故：点样后的斑点直径一般为0.2cm。③避免污染：切勿用手直接接触薄层板面，必要时戴上手套。二、实验记录2.1实验条件2.1.1制版过程：材料：3g的硅胶和0.5%羟甲基纤维素钠8ml（实验室提供试剂，利用普通天平称取硅胶、利用10mL量筒量取CMCNa）并利用小烧杯混合搅拌均匀。实验时间：约20min实验技巧：将糊状物倒至洁净玻璃板正中间，形成连续的一条线，并马上开始左右来回晃荡，使糊状混合物向着玻璃板的两边蔓延。在边缘的地方利用晃荡和药匙凃均匀后，再晃荡几次，使得全部糊状物在玻璃板上均匀的形成涂层。实验失误：在实验中，第一次由于糊状物搅拌时间过久，变浓厚而不易使涂层变均匀，故导致制作的结果较差。2.1.2后续实验过程：材料：上一次同学制作的层析板（根据后续实验可知该板的质量不高）、4瓶已经配制好的溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、前3种的任一比例混合物）、已经含有展层-显色剂的层析缸及烤箱等。实验时间：1h左右实验技巧：在点样过程中，必须垂直点样，使样液能充分被吸收。各实验过程按照要求即可，注意划线以处理后续实验。实验失误：无2.2实验现象2.2.1制版过程：在自然晾干后，可见图一所示的层析板。2.2.2后续过程：在点样后，溶液干燥后不能再明显分析斑点的外围。在层析约30min后溶剂前沿到达层析板的2/3处左右，可以取出并烘干。溶剂前沿并不是一条直线，故可认为该层析板制作质量不太高。在利用烤箱烘干后，层析板上出现5个蓝紫色斑点，相互分析。结果可见图二。图一层析板图二实验后的结果2.3实验原始数据实验数据即为各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离和溶液前缘至样品原点中心的距离记录，如下表：表一原始数据记录表各斑点样品原点中心距离前缘至原点中心距离丙氨酸3.60cm6.50cm精氨酸2.10cm6.40cm甘氨酸3.05cm6.40cm混合点12.01cm6.40cm混合点23.50cm6.40cm说明：由于溶剂前沿并不是一条直线，故我们选取了各斑点垂直的实验数据，以提高实验的准确率，减少实验误差。6.50cm3.60cm6.40cm3.50cm3.05cm2.10cm2.01cm三、结果与讨论3.1结果处理利用原始数据，根据实验原理中的计算方式计算Rf值：Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到斑点对应前沿的距离可得表二如下：各斑点Rf值氨基酸名称丙氨酸0.554精氨酸0.328甘氨酸0.476混合点10.314精氨酸混合点20.547丙氨酸根据Rf值，我们可以测定并粗略地得到结果：在一定的系统误差和实验误差的允许条件下，混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸两种氨基酸。3.2讨论3.2.1结果上的误差原因在实验的结果中，我们可以发现混合点1（精氨酸）0.3140.328Rf测定的标准值混合点2（丙氨酸）0.5540.547Rf测定的标准值。原因可能有：①在整个实验过程中，层析板的制作是基础，硅胶分布的均匀与否直接影响了实际的实验。而从溶剂前沿的弯曲可以知道，实验所用的层析板质量不是很好，一定程度上影响了实验的数据测定，导致实验的误差。②人为误差的存在，在判定斑点前沿和测量距离时，存在一定的误差，导致了结果上的不一致性，但这类影响较小。③操作过程中存在一定的误差，如层析时间不足等都有可能导致。3.2.2对实践的指导与应用价值①学习制作层析板的技巧，多做多练，在练好基础技能的前提下，可以提高实验的准确率和成功率。②提高并严格按照各项操作的标准做实验，在此基础上对实验结果进行讨论和分析3.3结论薄层层析法操作简单，在实验的结果上也比较的精确，能有效地分离出样品各组分。运用在本实验，效果也较好。最终可以得到结果：混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸两种氨基酸。3.4思考题3.4.1硅胶的吸附力与含水量的问题答：硅胶属于极性吸附剂，根据活性级别越大，吸附能力越小的关系活性级别硅胶含水量（%）吸附力Ⅰ0Ⅱ5Ⅲ15Ⅳ25Ⅴ38即硅胶的吸附能力与含水量呈负相关，含水量高，活度级数高，吸附力弱，反之亦然。3.4.2吸附实验中吸附剂的选择根据答：吸附剂的选择一般需要根据实验来确定。所选的吸附剂应有以下几个特点：最大的表面积和足够的吸附能力不断增强对待不同的分离组分应有不同的吸附能力与溶剂和样品成分不会发生化学反应颗粒均分，不会碎裂。一般的选择标准可有：被测成分特点吸附剂选择洗脱剂极性极性大（有亲水性）吸附性较弱（活性较低）极性大具有亲脂性吸附性强（活性高）极性较小3.4.3氨基酸纸层析，两者有何区别答：两者的区别见下表：不同点纸层析薄层层析支持物不必铺板，滤纸即为支持物利用硅胶铺板，制作层析板固定相水硅胶层析方向水平型垂直型吸附性较弱较强选择的展开剂极性较强极性一般结果的精确性较为粗糙但快速确定组分组分的确定较为精确