基因文库

基因文库：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也即这个生物体的基因文库。基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。基因文库的分类基因组文库是由一种生物的所有基因组DNA构建而成的。cDNA文库是利用从RNA序列反转录形成的cDNA序列构建的。酵母人工染色体(构建高等真核生物基因文库设计)特殊序列文库是针对某些特殊基因或序列而建立的。基因组文库：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的片段，然后连接到某种载体上转化受体细胞而形成的克隆的集合。基因组文库构建的基本步骤：（1）基因组DNA的提取及片段化（2）载体的选择和制备（3）DNA片段与载体连接形成重组DNA（4）重组DNA转化宿主细胞1、基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右。AAAA如先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段基因组DNA文库的构建流程2、基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；第二，保证DNA片段大小均一。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分。酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以提高文库质量。3、载体和受体的选择与制备由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选柯斯质粒或插入型λ噬菌体载体。载体制备中的注意事项：1）载体本身要完整2）载体去磷酸化要彻底3）载体纯度要高用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌，根据载体不同，需要对受体制备感受态或进行合适的培养。4、连接重组、包装、转化/染连接：将制备好的基因组DNA片段与载体DNA混合，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，形成重组载体。★基因DNA和载体DNA片段要足够纯，杂质少；连接时基因DNA片段与载体片段的摩尔比很重要，根据情况采用载体驱动或基因驱动策略；连接酶容易失活，操作条件很重要，16℃连接一至数小时。★质粒载体等的连接产物可以直接转化宿主。包装：基因片段如果与λ载体重组，则重组λ需要包装进入特别制作的外壳蛋白中(包装蛋白要妥善保存)，然后用于感染大肠杆菌，产生噬菌斑。5、文库的质量检测克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高(4-6倍或更高)；λ文库的滴度检测：1微克包装λ感染大肠杆菌后产生的噬菌斑的数量(pfu/μg)，100万以上才合格。平均插入片段长度：小片段文库采用酶切法或PCR法结合电泳进行检测，大片段文库采用PFGE电泳进行检测。重组率：有目标片段插入的克隆子数占总克隆子数的百分比，许多文库的载体系统可以采用蓝白斑鉴定重组率。覆盖度：覆盖倍数=平均插入片段长度×克隆数/基因组DNA的长度。或：覆盖倍数=所有探针筛选到的阳性克隆子数/总探针数。基因组文库构建的关键：★具有包装能力的载体系统：★离体包装系统粘粒λ噬菌体对带有外源DNA的杂合分子有直接筛选和富集的作用。提高重组DNA分子产生克隆的频率具有包装能力的载体系统㈠粘粒载体又称柯斯质粒是一种克隆载体，由质粒pBR322和λ噬菌体的cos粘性末端构建而称成，大小为4.6Kb，容量为29-45Kb。是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。粘粒作为载体的特点是：★除一般质粒的特性外还能装载大片段的外源DNA，★有可以识别噬菌体包装的“cos”位点。★包装时，只有能够达到所需片段的分子量标准的重组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的颗粒。★然后，经过转导将外源DNA克隆化，达到建库目的。具有包装能力的载体系统㈡λ噬菌体载体插入型载体取代型载体插入型载体，只有一个可供外源DNA插入的酶切点。取代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的DNA片段可以被外源DNA取代。目前，取代型载体应用最广泛离体包装系统由两种具有突变的溶源化的大肠杆菌组成。溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的潜在能力的菌株。离体包装系统cDNA文库从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。cDNA文库的特点：基因特异性器官特异性代谢或发育特异性不均匀性各CDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）cDNA文库构建的基本步骤（1）细胞总RNA的提取并分离纯化出mRNA（2）合成cDNA的第一条链（3）将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA（4）双链cDNA与载体连接形成重组DNA（5）重组DNA转化宿主细胞（1）细胞总RNA的提取并分离纯化出mRNARNA提取方法：CTAB法、异硫氰酸胍法等。mRNA的分离纯化：mRNA只占总RNA的1%-5%分离纯化原理：利用mRNA含有一段polyA尾序列，将其从总RNA中分离。方法：寡聚（dT）-纤维素柱层析法（2）双链cDNA的合成第一条cDNA链的合成：反转录法第二条cDNA的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子,然后以第一链为模板，利用DNA聚合酶合成双链DNA分子(3)ds-cDNA与载体DNA相连1)人工接头：要求具平端ds-cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂2)同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接3)cDNA的定向插入(4)重组cDNA分子的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为λ载体，则需进行体外包装、感染等。酵母人工染色体（YAC）构建高等真核生物基因文库；容纳的DNA片段可达106YAC的组成:端粒(TEL)序列着丝粒(CEN)自主复制序列SUP-4(外源DNA插入失活的选择标记)URA3和TRP1A.经大肠杆菌扩增后的载体DNA，用BamHI切去载体的填充部分B.用BamHI或NotI切开克隆位点然后使两臂分别与经部分酶解的DNA大片段两端连接，形成带有外源片段的YACC.通过转染方式将重组后的YAC导入受体细胞D.筛选：利用互补方式将带有YAC的酵母细胞营养缺陷型筛选出来。酵母人工染色体的构建架式库染色体分类库显微切割法建库特殊序列文库