人胚胎干细胞研究进展

人胚胎干细胞研究进展南京医科大学组织胚胎教研室江苏省生殖医学重点实验室周作民•干细胞的基本概念•胚胎干细胞系的建立过程•胚胎干细胞研究的进展情况•胚胎干细胞的研究意义•胚胎干细胞研究的困难及解决办法人体发生过程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子合子卵裂球桑椹胚囊胚滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层体表结构；神经系统干细胞的基本概念1、定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。2、分类：（1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。横向分化：部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.永生化(immortal)；3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程；胚胎干细胞的性质胚胎干细胞系的建立过程分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺脊细胞------胚胎干细胞的鉴定------定向诱导分化-------成体干细胞-----功能细胞1、干细胞来源：(1)发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞(2)从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（embryonicgerminatecells）(3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞（embryonalcarcinoma,EC)(4)生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT）去核卵细胞+体细胞核克隆囊胚分离内细胞群ES细胞2、胚胎干细胞的分离酶消化后培养免疫方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法3、培养条件：(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化。4、胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞具有以下特点：(1)细胞内碱性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高(3)不被Hoechst33342和Rhodamine123染色(4)细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81(5)能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6)可诱导分化为各种成体干细胞干细胞特性胚胎干细胞生殖干细胞SSEA-1－＋SSEA-3＋＋SEA-4＋＋TRA-1-60＋＋TRA-1-81＋＋AKP＋＋Oct-4＋未知端粒酶活性＋＋滋养细胞＋＋培养条件滋养细胞＋无血清培养＋bFGFLIF＋bFGF＋Forskolin胚胎干细胞的诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞--------------------------------------------造血细胞RA胚胎干细胞----------------------------神经细胞DMSO胚胎干细胞----------------------------肌肉细胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞----------------------------血管和内皮细胞RA+胰岛素+T3胚胎干细胞----------------------------脂肪细胞BMP-2,BMP-4胚胎干细胞----------------------------软骨细胞地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞----------------------------骨细胞基因转染胚胎干细胞----------------------------胰岛素分泌细胞干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达造血干细胞的鉴定：（1）细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小（2）细胞表面标志：flk-1（FetalLiverKinase1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；（3）基因表达：TAL-1；GATA-2；βH1；β主要珠蛋白内皮细胞:（1）细胞形态：扁平贴壁状态；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡（2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3；CD34；JAM(JunctionalAdhesionMembrane)；MECA-32以及MEC-14，7抗原（3）特异基因表达：flk-1；flt-1；tie-2心肌干细胞：（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝（2）细胞功能：节律性收缩；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If（3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链神经干细胞:（1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突（2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体（3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志）（4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和GluR-6，递质合成酶TH和GAD67，GAD65，GFAP和NF-L的表达胰岛细胞:细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3β（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2）；胰岛β细胞的特征及特定标记物：胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）；转录因子IPF1/PDX1和NgN3（Neurogenin3）胚胎干细胞研究的进展情况1981年，Evans和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞。1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞2000年，Reubinoff等建立了两株人胚胎干细胞。2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。研究意义人胚胎发育机制及影响因素的研究。用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体和动物的实验及临床研究。将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体细胞、组织和器官。1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。胚胎干细胞研究面临的问题及解决办法用于干细胞研究的胚胎来源困难如何保持胚胎干细胞的全能性，并控制向特别类型细胞转化？如何分离、纯化干细胞？分化后的细胞是否有致瘤性？干细胞在体外发育成完整的器官尚难以做到。分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥伦理问题解决胚胎来源有限的途径：未成熟卵的体外成熟避免免疫排斥的方法（1）Knock-out胚胎干细胞的组织相容性抗原（2）Knock-in受者的组织相容性抗原（3）与同一来源的造血干细胞一同移植（4）受者的体细胞核移植ES细胞研究的趋势改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？