引物设计和PCR经验

primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得一、引物设计stepbystep1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用PrimerPremier5搜索引物①打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。3、用Oligo验证评估引物①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Currentoligolength来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。②Analyze中，第一项为Keyinfo，点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。③Analyze中第二项为DuplexFormation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其DeltaG值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。④Analyze中第三项为HairpinFormation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。Analyze中第四项为CompositionandTm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbormethod、％GCmethod和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。第五项为FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有Falsepriming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且DeltaG值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。二、引物设计过程中的心得1、Primer5.0搜索引物①PrimerLength我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。②PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。③Searchparameters还是选Manual吧，Searchstringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。2、Oligo6.0评估引物①在analyze里，DuplexFormation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，Themoststable3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol,ThemoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，ThemoststableDimeroverall6.7kcal/mol没有问题。②HairpinFormation根据黄金法则③Falseprimingsites:Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimalannealingtemperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。⑤Internalstability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。3、其他①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。RealtimePCR经验谈：从RNA的提取到PCR一引物的设计引物的设计对于这个实验至关重要，因为realtimepcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。realtimePCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。5，注意引物设计好后的产物长度。REALTIMEPCR的最佳产物长度在150-250kb左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法来比较基因表达量的高低。二模板的要求归根到底，REALTIMEpcr想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：1，用TRIZOL提取RNA有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般6孔板中两个孔就可以提取出RNA）。2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组DNA，对上机做REALTIMEPCR很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。3，提取完后用乙醇溶解要尽可能