Maldi-tof技术与质谱仪的使用

MALDI-TOF技术与质谱仪的使用南开大学元素所张森MALDI技术•离子化技术：MALDI–Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization•MALDI技术的原理–样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜–激光照射，基质吸收能量–基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。MALDI技术中基质的作用•基质的作用–把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。–基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。–帮助样品离子化。常用基质及选择基质样品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物HPA核苷酸Dithranol非极性聚合物IAA非极性聚合物LaserSampleTargetDetectorClockTime-of-FlightMolecularMassTOF的基本原理EnablingLifeScienceToolsBasedonMassSpectrometryTMEk=zqUEk=1/2mV2V2=2qUz/m=2qU/(m/z)triggerdiodelaservariableattenuator250l/sturbo250l/sturbo1.8mlinearMALDITOFMS的构成检测器1：线性模式检测器2：反射模式反射模式下TOF的分辨率高于线性模式线性模式和反射模式优缺点所选方法（即flexcontrolmethods）反射模式（linear）1.一般测试分子量小于4000的样品2.分辨率高，单同位素清晰准确线性模式（reflection）1.一般测试大分子量样品（M4000）2.分辨率低，得到是平均分子量的质荷比样品和标准品点靶•标准品的作用：对仪器参数进行校准，使样品测试的质量准确度更高。注意：样品和标准品，必须点靶方式一致，所选基质一样。内标法和外标法•内标法:样品与标准品点在同一靶点。–优点：样品和标准点条件一致，质量准确度更高，质荷比可准确到0.02。–缺点：标准品干扰样品出峰。•外标法:样品与标准品点在不同靶点。–优点：无标准品干扰–缺点：质量准确度低，质荷比准确到0.1。MALDI常用点靶方法•干滴法（DriedDroplet）–样品和基质充分混合，点样样品靶上。注意：以HCCA和DHB为基质的样品，一般用干滴法点靶•薄层法–先将基质点于靶上，带基质结晶后，再把样品溶液点于基质的层上。–注意：以HPA为基质的样品，都要采用薄层法。点样方法：DriedDropletmatrixanalytesamplesolutionsampledepositionAnalytedispersedthroughoutmatrixcrystalsEnablingLifeScienceToolsBasedonMassSpectrometryTMMALDI-TOF质谱仪的使用1.标准品点靶；样品点靶；2.进样品靶；3.质谱测试和图谱保存：flexcontrol软件；4.图谱读取和分析：flexanalysis软件点靶注意事项•移液枪的使用–取不同试剂，需要更换一次性枪头。•点靶注意事项–防止基质污染，防止标准品污染，防止样品靶污染，防止试剂污染–防止样品靶跌落–点靶时，枪头请勿接触样品靶（悬点）–点完靶，请在靶表相应位置标明样品名进靶和退靶1.点击仪器右侧面的绿色按钮（loadandeject按钮）。2.在flexControl软件里，点击carrier后面按钮进退靶按钮质谱测试和图谱保存质谱测试的软件是：flexcontrol•打开软件•选择方法•校准仪器的参数（与ESI-MS（LCQ）差别）•扫描样品•保存数据•上传数据至大型仪器管理平台文件系统打开桌面Flexcontrol软件双击打开flexcontrol选择方法选择方法方法的选择•根据分子量大小选择相应的方法–方法路径：D:\methods\flexcontrolmethods\usualmethod–一般样品正离子都能出峰；对于正离子模式不出峰的样品，改换为负离子模式的方法扫描。•更换方法时，对以前的方法不要保存。选择方法L:线性模式R:反射模式P:正离子模式N:负离子模式PepMix:多肽混合物，适合范围700-4000DaProtMix:蛋白混合物，适合范围5000–20000DaClinProt:多肽/蛋白化合物，适合范围1000–20000Da66kDa:大分子蛋白，适合范围20000-100000DaProteomics_HPC:高精度校正，适合范围700-4000DaRP_lowmolecular_HPC高精度校准，适合范围100-1000Da2.反射模式；正离子；高精度；700-4000Da；与RP_PepMix.par差别不大1.反射模式；正离子；700-4000Da3.线性模式；正离子；700-4000Da4.反射模式；负离子；700-4000Da5.线性模式；正离子；5000-20000Da6.线性模式；负离子；700-4000Da7.反射模式；正离子；100-1000Flexcontrol的按钮检测范围，可微调扫描区放大表峰显示单次扫描显示叠加图保存数据的按钮校准仪器的参数1.扫描标准品时，出峰太弱，多叠加几次。2.点击Calibrate，选中叠加图，点击自动校准（automaticassign），点击apply，即完成自动校正。3.如果自动校准通过不了，进行手动校准。注意：必须有三个以上的点匹配上，匹配点越多越好手动校准扫描样品和保存数据1.找到样品点的位置2.扫描样品，叠加并保存数据注意：数据要保存到课题文件夹内，例如：刘育课题组数据保存到D:\data\Liuyu\2011\06在flexAnalysis打开保存的路径样品的名字保存的是叠加图FlexAnalysis方法，可不选择数据的上传•找到所保存的数据文件•右键点击发送到压缩文件夹（zipped）•打开大型仪器管理系统网站（less.nankai.edu.cn）文件系统，上传压缩后的数据文件夹。MALDI质谱图解析•常见离子峰：–正电荷模式：加质子峰；加合碱金属峰（加Na+峰；加K+峰）;减e-峰–负电荷模式：加e-峰，加Cl-•多出现单电荷分子离子峰，双电荷和多电荷峰弱或几乎不出现。MALDI-TOF对样品的要求•MALDI优点：耐受高浓度的盐、缓冲剂和其他非挥发性的成分。•两种杂质严重影响MALDI测试：–离子型去垢剂（表面活性剂），如十二烷基硫酸钠；–低挥发溶剂，如DMSO、DMF和甘油注意事项1.点靶，枪头不得接触样品靶；点靶的样品和基质混合物，不超过1μl。2.正离子一般均可出峰，如果正离子未出峰，换负离子模式检测。3.点样样品不得含有DMSO和DMF等非挥发性溶剂。