高中生物选修一课题1---DNA的粗提取与鉴定

专题5课题1DNA的粗提取与鉴定一、基础知识分析（一）DNA的提取原理1、DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同问题思考与讨论：①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？NaCl浓度为0．14mol／L时DNA的溶解度最低。小于或大于0.14mol／L，溶解度就逐渐增大。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离2、DNA在酒精溶液中的溶解性3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响（二）、DNA的鉴定原理①DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂②甲基绿（绿色）二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？哺乳动物的红细胞和液体培养基中的大肠杆菌•从核DNA数目来看，猪38条，鸡血78条，哺乳动物红细胞0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。最好选择？鸡血、猕猴桃（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞【鸡血细胞】讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2、植物细胞【洋葱】讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等.讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.（三）去除滤液中的杂质【阅读方案一】讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；【酶的专一性】方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离【DNA的稳定性】【阅读方案二、三】（四）DNA的析出与鉴定与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％）1、DNA的析出2、DNA的鉴定DNA＋二苯胺甲基绿沸水浴蓝色绿色讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（2）这一鉴定结果说明什么问题？（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取三、实验案例②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得1、准备鸡血细胞液①过程：②柠檬酸钠作用:讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆.取柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。防止血液凝固将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL烧杯中。取其滤液。2、提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至涨破（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA3、溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA溶解在溶液中。然后，用放有纱布的漏斗过滤，取其滤液。加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时氯化钠为0.14mol／L）4、析出含DNA的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出.5、滤取含DNA的粘稠物用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤4中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上6、将DNA的粘稠物再溶解取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol／L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中.7、过滤含有DNA的氯化钠溶液取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤6中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中.8、提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95％的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA9、DNA的鉴定二苯胺【水浴加热】答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”讨论：①两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第二次：使DNA黏稠物析出（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次、第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第二次：DNA被留在纱布上第三次：DNA存在于滤液里③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液含杂质多第二次：用冷却的95％的酒精含杂质少④六次搅拌其中除第一步外，其余均要朝一个方向搅拌，搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备四、课题成果评价（一）是否提取出了DNA本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质（二）分析DNA中的杂质（三）不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好Ⅱ.（7分）下列是DNA粗提取与鉴定的实验（1）实验原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同。在2mol/LNaCl溶液中，DNA溶解，部分蛋白质盐析生成沉淀；在mol/LNaCl溶液中时，DNA析出。DNA不溶于溶液，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。在沸水浴的条件下，DNA溶液遇试剂会被变成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA。（2）制备鸡血细胞液时，要在取新鲜鸡血的同时加入，使血液分层，取下层血细胞沉淀。（3）在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，其目的是为了。0.14酒精二苯胺柠檬酸钠使血细胞吸水膨胀破裂（4）提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定量的和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集。洗涤剂研磨液Thanks