真菌培育技术

第六章药用真菌培育技术一、概述自然界中的真菌种类繁多，按经典分类属植物界；通常所说的药用真菌，多限于生长发育到一定阶段能够形成个体较大的子实体或菌核的高等真菌；已知的药用真菌分布于40多个科中，它们在生长发育代谢活动中，能够产生氨基酸、多糖、生物碱、甾醇、萜类、苷类以及维生素等对人体疾病有抑制或治疗作用的物质。第一节药用真菌培育研究概况★药用真菌，如：僵蚕、麦角、马勃、冬虫夏草（寄生在幼虫蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体）、猪苓、雷丸等；★食药兼用菌，如：黑木耳、银耳、香菇、松江蘑（松茸）、亮菌（假蜜环菌的菌丝体）等.冬虫夏草猪苓松茸★直接利用子实体、菌丝体或菌核入药茯苓（菌核，多寄生于马尾松或赤松的根部）麦角（为麦角科真菌麦角菌寄生在禾本科植物黑麦等子房中所形成的菌核）；★利用所产生的菌素物质入药，如猴头菌素、亮菌素等。★主要入药部位：菌索、菌核和子实体菌索：菌丝平行结合成绳索状；菌核：菌丝组成坚硬的休眠体子实体：高等真菌在生殖时期形成的有一定形状和结构,能产生孢子的菌丝体。茯苓★随着从平菇、草菇、金针菇中发现抗癌成分，从真菌中寻找抗癌药为业界所瞩目。从银耳、茯苓、猪苓、云芝和香菇等担子菌中所提取的真菌多糖，具有对肿瘤有较强的抑制作用且毒性极小，不同于其他毒性类药物直接杀伤细胞，从而为抗癌药物的研究与应用开辟了新途径，引起国内外高度重视。二、药用真菌培育发展概况东汉紫芝的栽培方法唐代木耳的栽培方法宋代和元代香菇的栽培方法我国银耳栽培始于近代的光绪20年（1894年），100多年来除我国能大规模生产外，世界上只有少数国家和地区能小批量栽培。新中国成立后，对灵芝、蜜环菌、亮菌、猴头、猪苓、茯苓等进行了发酵、药化、药理及临床等方面的综合研究，新工艺的形成使麦角新碱、密环菌片、亮菌片等的生产周期大大缩短。现在药用真菌的来源已有野生采集、人工栽培和工业化生产3个途径。随着现代生物技术的广泛应用，药用真菌的开发与利用将显现出广阔的前景。第二节药用真菌的生活习性一、药用真菌的生活方式异养★共生从活的有机体吸取养分，同时又提供该活体有利的生活条件。猪苓与密环菌菌根真菌★伴生松散联合，可以是一方得利，也可双方互利。银耳与香灰菌银耳分解纤维素和半纤维素的能力弱，也不能充分利用淀粉，只有与香灰菌丝混合接种在一起时，才能较好地利用香灰菌丝分解木屑的产物繁殖结耳。★腐生从死亡的动植物体或其他无生命的有机物中吸取养分1．专性腐生菌木腐生菌：香菇、银耳草腐生菌：草菇、双孢蘑菇2．兼性腐生菌以寄生为主但也具有一定腐生能力的真菌，如安络小皮伞类。★寄生从活的动植物体上吸收养分1．专性寄生菌冬虫夏草、麦角菌2．兼性寄生菌兼有腐生菌和共生菌的特征密环菌类在枯木上腐生，也和兰科植物天麻共生黑木耳二、药用真菌生长发育的环境条件（一）药用真菌的生长1．菌丝体的生长菌丝体以顶端为生长点，不断向四周呈辐射状伸展，形成菌落。2．子实体的分化发育菌丝聚集、子实体分化、发育及成熟人工虫草菌丝体灵芝孢子粉（二）药用真菌生长发育的环境条件1．温度一般菌丝体较耐低温，在0℃左右只停止生长，并不死亡，最适生长温度为18～28℃；子实体发育温度较一般植物为高，且因菌种类而异①低温型：适温在20℃以下,如香菇。②中温型：适温在20～24℃之间,如银耳。③高温型：适温超过24℃,如灵芝。2．水分和空气相对湿度菌丝体和新鲜子实体中约有90%的水分，它们绝大部分来自培养基，所以培养基最适含水量一般在60％左右；大多数菌丝体生长要求空气相对湿度为65%～75%；子实体发育阶段为80%～95％。3．空气大多是好气性菌类CO2浓度子实体形成前期（0.034%～0.1％）是必要的，后期0.1％以上对子实体有毒害大于0.1％时，双孢菇往往出现菌柄长、开伞早；超过0.6％时，菌盖出现畸形；灵芝在CO2浓度为0.1％时，一般不形成菌盖，菌柄分枝呈鹿角状。4．光照菌丝生长时一般不需要光，但子实体分化发育时大部分需要一定的散射光，而直射光不利于生长。喜光型真菌香菇、草菇、灵芝、金针菇厌光型真菌双孢蘑菇、茯苓等中间型药用菌黄伞5．酸碱度大多数药用菌喜pH值3～6.5的偏酸性环境，最适为5.0～5.5；大于7.0时生长受阻，大于8.0时生长停止。草菇喜中性偏碱的环境。在配制培养基时应将pH值适当调高，或添加0.2％磷酸二氢钾作为缓冲剂。第三节药用真菌菌种分离与培养一、药用真菌的营养与培养基的制备（一）药用真菌的营养1．碳源纤维素、木质素、单糖、有机酸等2．氮源马铃薯汁、麦麸、马粪等在子实体形成期培养料中氮素的含量须低于菌丝生长期，一般菌丝生长期碳氮比为15～20∶1，出菇期为30～40∶1。不同的菌类对碳氮比的要求会有一定差异。3．水分在真菌有机体中含量最大。4．无机盐类钾、钠、钙等。磷、硫、钾等元素在培养基中的适宜浓度为100～500μg/L，而铁、钴、锰等需要量甚微（千分之几毫克）。5．生长因素是真菌生命活动中不可缺少而需要量又极少的有机营养物质，如维生素等。维生素在120℃以上时易被破坏（二）培养基制备天然培养基:利用含有丰富营养的天然有机物质制成的培养基合成培养基:利用已知成分的化学药品配制成的培养基半合成培养基:采用部分天然物质为碳源及生长因素的来源，再添加些无机盐类。固体培养基和液体培养基二、消毒与灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤除菌法紫外线灭菌法药物灭菌法0.1%升汞液可作非金属器皿和材料的表面灭菌2%～5%漂白粉液可用于恒温室、接种室墙壁消毒。70%～75%乙醇可作非金属器皿和材料的表面灭菌。7.5ml/m3的甲醛-高锰酸钾熏蒸接种箱、无菌室三、菌种的分离培养与保存复壮（一）菌种分离培养组织分离法是指通过药用真菌菌体组织或其生长基质分离提纯菌丝的方法。孢子分离法是利用真菌的孢子，在适宜的培养基上萌发长成菌丝体以获得纯菌种的一种方法。它可分为多孢子分离法和单孢子分离法。寄主分离法对于茯苓、木耳、银耳、香菇等木质腐生菌，可以从其寄主板木上分离出菌丝做菌种，或直接做原种和栽培种。菌种的保藏斜面低温矿油保藏砂土保藏液态氮超低温固体保藏砂土处理接菌干燥（二）、菌种保藏斜面低温法斜面培养基上培养到菌丝旺盛生长移放到4℃左右的冰箱中经3～6个月转接一次使用前一两日置常温下活化转管麸曲法用麸皮加水拌匀,分装于小试管,厚约1.5cm；常规灭菌,冷却后接入菌种培养至长好室温下放入装有CaCl2的干燥器中干燥几日,20℃以下可保藏1～2年。石蜡油封藏法在菌种的表面灌注无菌的液体石蜡；直立放在低温干燥处保存1～2年。保藏孢子，可将砂土装入小试管并经过严格灭菌后，再将无菌孢子拌入其中，用石蜡封口。（三）、菌种的衰退与复壮菌种的衰退多次无性繁殖、培养条件影响菌种的复壮采用低温保藏，培养温度不宜超过28℃。减少传代,控制突变型在数量上取得优势的机会。单菌落分离,选育生产性能良好的菌株，并有计划地把无性和有性繁殖的方法交替使用，组织分离最好每年进行一次，有性繁殖3年一次。淘汰已衰退的个体，选择有利于高产菌株的培养条件。四、接种培养（一）一级菌种（母种）的培养制斜面培养基选优良健壮成熟的种菇,在无菌条件下取一小块接于培养基上；置25～30℃下培养出菌丝,即得纯菌种。（二）二级菌种（原种）培养选适当配方，营养成分高于母种培养基，灭菌。从母种内挑取4～5mm3的小块放入培养基中央；置适温培养至菌丝长满瓶。（三）三级菌种（栽培种）的扩大培养选择适当的配方，营养再高于原种；取原种长满菌丝的小块（或木块1～2片与混合物少许），接入瓶内；培养至菌丝长满瓶。制种后可接种在不同的培养基（如段木、袋用料等）上大规模培养原种、栽培种生产培养基的配制木屑-米糠培养基种木培养基米粉培养基灭菌高压蒸汽与常压蒸汽灭菌原种、栽培种生产接种每支试管可接4～5瓶原种，每瓶原种可接50～80袋栽培种。培养一般培养温度为20～28℃，在接种12h后，菌种即可恢复生长；2～3d后，种块上菌丝逐渐伸入培养基内；1周后有的菌种有红褐色、褐色或黄色分泌物出现，有的有原基出现，可用于生产。袋料栽培虫草培育段木栽培药用真菌人工栽培第四节药用真菌的人工栽培段木栽培段木的准备加强管理场地的选择接种病虫害防治（一）选择场地与真菌种类有关茯苓喜酸性砂壤并排水良好的南坡灵芝、银耳选水源方便、遮阴潮湿、避风向南的场地。（二）段木准备野生壳斗科植物营养丰富、水分适中时期砍伐,常以晚秋落叶后到第2年春树木萌发前为好剃枝、锯段、干燥、打孔等项处理。（三）接种栽培的关键接种前应严格检查段木组织是否枯死水分状况是否适中选择阴天进行为宜。（四）管理栽培的关键保持栽培场地清洁；搭棚、遮阴、加温、喷水等调节菌对光照、温湿度、空气的要求。（五）杂菌污染与病虫害防治霉菌、线虫及白蚁霉菌青霉、曲霉、毛霉等培养基灭菌要彻底；严格检查菌种质量，适当加大接种量；立即销毁污染菌种。线虫由土壤或水进入段木,蛀食菌基部。段木靠地面不宜太近,保持水源清洁；覆土材料最好进行巴氏消毒，并在地面上撒施石灰；隔离病区，停水使其干燥，并用1%的冰醋酸清洁处理烂穴,防止蔓延。黑翅大白蚁（六）采收因菌类不同从接种到采收所需时间及采收次数各异。银耳接种后40日即可陆续采收多次；灵芝4个月收获，每年可收2～3次。代料栽培工艺流程菌种准备（母种→原种→栽培种）→备料→配料→装袋→灭菌→接种→菌丝培养→出菇管理→采收→加工袋料栽培工艺流程菌种准备备料配料装袋灭菌加工采收出菇管理菌丝培养接种技术要点（1）栽培材料阔叶树的木屑和农业废料，（2）栽培方式瓶栽、袋栽、箱栽、菌柱栽培、床栽、阳畦床栽、室内层架式床栽等。（3）栽培场所专业菇房，也可利用清洁、通风、明亮的房子改作栽培场所。使用前必须消毒。（4）栽培与管理按生产季节安排培养基按常规配制与灭菌，发菌阶段一般在20～24℃培养，培养室的温度超过30℃时菌丝生长会受到影响。（5）采收与加工去除残留的泥土和培养基，按质量标准进行加工