质粒构建-protocol

一，引物设计:1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。1，使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。2，设计引物：primer-up：---------Primer-down：-----------3，核对----送公司合成。4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at4℃保存。二，PCR（P出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：1，揺菌过夜：2ul韩家淮实验室的菌液，Xul相应的抗生素3mlLB94℃5min2,pcr:菌液1ul94℃30sec2xPFUmix25ul58℃30secPrimer1ul72℃Xmin2dH2O23ul72℃5min（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：称0.6g的琼脂糖加入60ml的1XTAE加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时)25分钟后，即可点样跑胶。（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，ElutionBuffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温保护碱基4个上游酶切位点首位20个碱基保护碱基4个下游酶切位点末尾20个碱基的反向互补碱基15ml离心管Pcr(50ul)反应体系Pcr温度体系33cycles1%的琼脂糖胶：大块煮沸3次箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloadingbuffer2ul、2dH2O6ul。三，酶切、链接：1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）insert：上述胶回收产物35ul10xHbuffer（1.5x）7ul50ul的体系ddH2O6ul酶11ul酶21ul2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）Vector（1ug/ul）：2ul10xbuffer（1.5x）3ul20ul的体系ddH2O13ul酶11ul酶21ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。4，连接：2xRapidLigation6ulVector0.8ul12ul的体系insert4.5ul（目的是为了多加点insert）T4DNALignase1ul四，转化：{⑴、冰上20分钟-→热激：42℃、90秒-→冰上2分钟⑵、加1mlSOC（或者1mlLB），37℃、180rpm、45分钟。⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄）。⑷、250rpm、过夜。五，质粒大抽：六，收菌：取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4℃。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。（倒置于草纸上使液体流尽)。感受态细菌10ul质粒10ul七，重悬：每管加入8ml的RES-EF(RnaseA)，重悬细菌沉淀—充分Vortex或用枪头吹打沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3，裂解：每管加入等量的LYS-EFbufffer，即8ml。轻轻上下颠倒离心管4-6次，（勿震！！）室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染4，平衡：⑴：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）⑵：取15mlEQU-EFbuffer沿滤芯四周加入—充分平衡滤芯。注意：①离心管内的液体不要浸没滤柱的头，所以要勤于倒弃滤液，②在过滤平衡液的同时，进行5、6步，防止滤芯干掉。5，中和：在等待EQU-EFbuffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8mlNEU-EFbuffer，颠倒混匀，冰上孵育5min。（不能vortex）6，离心、过滤：⑴：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、at4℃--质粒存在于上清中。（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助）⑵：将上清吸入到平衡好的滤芯中,重力自流尽。7，洗一：过滤完毕后，吸取5ml的FIL-EFbuffer，沿滤芯四周加入（将粘在滤芯上的质粒洗下来）--过滤完后，将滤芯弃掉。8，洗二：往滤柱中加入35ml的ENDO-EFbuffer—去内毒素9，洗三：待滤完后再加入15ml的wash-EFbuffer—过滤。10，洗脱：取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5mlElu-EFbuffer.(Elu-EFbuffer预先放在50℃的恒温箱中加热，可提高洗脱效率)11，沉淀：待Elu-EFbuffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇（将质粒沉淀下来），混匀（充分vortex），静止10min---10000rpm、30min、4℃---弃上清。12，洗涤：加5ml的70％酒精（ETOH）或用15ml三蒸水（高压过）+35ml的无水乙醇配制（在超净台进行），混匀（上下颠倒即可），离心：10000rpm、10min、常温。弃上清，重复上述步骤一次（再洗涤一次）弃上清---到超净台用200ul枪头把上清尽量洗净----再空离一次，在超净台用小枪头把液体洗净---吹干。13，溶解：取100-300ul高压过的H2O-EF溶解质粒--定量后，将质粒的浓度调至1ug/ul—最后，保存到-20℃。