支气管哮喘小鼠气道反应性无创检测方法的建立

支气管哮喘小鼠气道反应性无创检测方法的建立李斌恺赖克方洪燕华王法霞陈如冲林少建钟南山【摘要】目的目前国内对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠的评价多数仅立足于气道炎性指标,不能完全反映哮喘的病理生理特征。本所率先从国外引进了小动物无创检测和有创检测肺功能仪。无创法检测时小鼠不必麻醉,而且每次可以同时检测多只小鼠,具有较大的优越性,但能否取代有创法尚需更多的数据。本研究旨在建立无创检测小鼠气道高反应性的检测方法,并与有创检测方法进行比较。方法根据动物模型和气道反应性检测方法不同,动物分为:①无创哮喘组;②无创对照组;③有创哮喘组;④有创对照组。采用卵白蛋白致敏和激发,建立BALB/c小鼠哮喘模型,生理盐水作为对照,分别用无创和有创的方法测定气道反应性。哮喘动物雾化吸入0.2～50g/L倍增浓度的乙酰甲胆碱(Mch),测定相应浓度下的增强呼气间歇(Penh)值或气道阻力(RL)值等指标。将小鼠吸入Mch后RL或Penh增加2倍的激发浓度以PC100来表示。所有动物都行支气管肺泡灌洗,收集灌洗液,涂片染色后分类计数。结果无创哮喘组PC100均≤6.25g/L,对照组PC100均≥12.5g/L。其Log2(10PC100)值(5.36±0.84)显著低于对照组(7.97±0.82)(P0.01)。无创哮喘组从Mch浓度3.12g/L开始,其Penh值明显高于对照组。有创哮喘组RL值从Mch浓度0.39g/L开始就明显高于相应对照组(P0.05)。无创组与有创组的气道反应性相关系数R=0.96(P0.01)。无创哮喘组和有创哮喘组的嗜酸粒细胞分别为(54.00±5.96)%,(55.93±5.92)%,显著高于各自对照组的(0.38±0.52)%,(0.63±0.74)%(P0.01)。结论本研究表明以Penh为主要测定指标的无创方法,可以成功检测哮喘小鼠气道高反应性。【关键词】小鼠;气道反应性;支气管哮喘;增强呼气间歇;无创检测【Abstract】ObjectiveMostoftheevaluationonasthmaticmousemodelonlybasedontheairwayinflammation,notfullyreflectingitspathophysiology.Noninvasivemethodofmeasuringbronchialhyperresponsivenesscandetectseveralconsciousmiceinonetime,butwhetheritcanreplacetheinvasivetechniqueneedsmoredatatobeidentified.Thisstudyaimstoestablishanon-invasivedetectionofmouseairwayhyperresponsiveness,comparingwiththeinvasivemethod.MethodsAccordingtodifferentwaysofdetection,miceweredividedintofourgroups:non-invasiveasthmagroup,non-invasivecontrolgroup,invasiveasthmagroupandinvasivecontrolgroup.Mousewassensitizedandchallengedwithovalbumin(OVA)forasthmaticmodel.Themicewerechallengedwithincreasingconcentrationsofmethacholineaerosolfrom0.2250g/L,andtheairwayresistancewasmeasured.Enhancepause(Penh)orairwayresistance(RL)wastakenforeachgroup.Thedoseofmethacholinecausing100%increaseofrespiratoryresistancewasdefinedasPC100.ThePC100valueswereconvertedintoLog2(10PC100)forstatisticalanalysis.Bronchoalveolarlavagecytologywasperformedtoevaluatetheairwayinflammation.ResultsThePC100ofnon-invasiveasthmagroupwas≤6.25g/L,andthenon-invasivecontrolgroup’s≥12.5g/L.ItsLog2(10PC100)valuewassignificantlylessthanthatofcontrolgroup,(5.36±0.84)vs(7.97±0.82)(P0.01).ThePenhvalueofnon-invasiveasthmagroupbegansignificantlyincreasingwhentheconcentrationofMchwas3.12g/L.TheRLvalueofinvasiveasthmagroupwasincreasingatthebeginningof0.39g/L(P0.05).Thecoefficientrateoftwogroupswas0.96(P0.01).TheEOS(%)ofnon-invasiveasthmagrouporinvasiveasthmagroupwas54.00±5.96,55.93±5.92respectively,significantlylargerthanthatofcontrolgroup(0.38±0.52,0.63±0.74,P0.01).ConclusionsThisstudyshowsthatsingle-chamberedbarometricwhole-bodyplethysmographyasanon-invasivelungfunctiontestcansuccessfullydetectairwayresponsivenessinasthmaticmousemodel.【Keywords】Mice;Airwayhyperresponsiveness;Bronchialasthma;Enhancepause;Noninvasivemethod从最早的电刺激离体气管平滑肌收缩能力测定,到现在的无创单腔整体体积描计,国外在对动物气道反应性的测定技术上经过了漫长的发展历程。而目前国内在对支气管哮喘(简称哮喘)小鼠的评价上多数仅仅立足于气道炎性指标,在气道反应性的检测方面近几年才起步,而且是用有创的方法。我所率先从国外引进了动物无创检测的肺功能仪。气管插管后再测定动物气道阻力的有创法是评价动物气道反应性的经典方法。无创法则不需气管插管等繁琐的步骤,在动物处于自然状态下就可以直接测定其气道反应性,而且每次可以同时检测多只小鼠,具有较大的优越性,但能否取代有创法尚需更多的数据。因此,我们有必要探讨其与有创法的相关性,判定其是否能够有效检测动物的气道反应性,以期建立哮喘小鼠气道反应性的无创检测方法。材料与方法一、仪器与试剂仪器:本实验采用美国Buxco公司小鼠无创肺功能仪和有创肺功能仪,是目前国际上通用的小鼠肺功能检测仪器,主要包括体描箱,压力传感器(流量传感器),信号放大器和雾化器等。其工作原理是,将乙酰甲胆碱(methacholine,Mch)或生理盐水(NS)等通过雾化器雾化入体描箱内,箱内小鼠吸入雾化气体后呼吸运动的改变引起箱内压力、流量产出相应的变化,连接于体描箱的压力传感器(流量传感器)将采集到的信号传至信号处理系统,并在信号放大器作用下转化为呼吸动力学各指标值。两套肺功能仪中,无创肺功能仪具有6个体描箱(也有配置更多的),相应的传感器可以将各个箱内压力、流量的变化同步传至信号处理系统处理,因此可以同步为多只小鼠进行肺功能检测。主要试剂:鸡卵白蛋白(OVA)(Ⅴ级,美国Sigma公司),氢氧化铝凝胶(美国Sigma公司),Mch(美国Sigma公司)。二、实验动物及分组实验动物:SPF级BALB/c雌鼠,5～6周龄,体质量18～20g,购自广州中医药大学实验动物中心,并在该中心饲养。饲料为去OVA(不含鸡蛋)的特殊食物。饲养环境符合SPF实验动物级环境设施标准。分组:根据动物模型和气道反应性检测方法不同,分为:①无创哮喘组;②无创对照组;③有创哮喘组;④有创对照组。其中,无创哮喘组、有创哮喘组每组10只小鼠;无创对照组、有创对照组每组8只小鼠。三、哮喘模型的建立方法实验第0天、第7天和第14天行腹腔注射致敏:模型组每次给予20μgOVA+150μlAl(OH)3+50μlNS(100mg/L)混悬液;对照组给予200μlNS。实验第28天、第29天和第30天行滴鼻激发;模型组每次给予50μlOVA2NS(2g/L)滴鼻,对照组给予50μlNS。四、检测的指标及原理无创组用体积描记法测定增强呼气间歇(enhancedpause,Penh)如图1[1]所示:曲线反映的是体描箱内小鼠呼吸时的压力变化;曲线上部分为呼气相,下部分为吸气相;气流受限时,曲线的呼气相部分明显延长,呈现阻塞性通气功能障碍时特有的呼气末凹陷,呼气相延长的程度反映了气流受限的程度,定义为呼气间歇(Pause),用吸气峰流速(peakinspirationpressure,PIP)及呼气峰流速(peakexpirationpressure,PEP)比将其标准化即得Penh,此参数即可反映气道反应性。计算公式如图所示:其中Te代表呼气相时间,Ti代表吸气相时间,Tr代表呼气相“松弛时间”即呼气相描记箱内压力衰减为PEP的36%所用时间。Penh=PEP/PIP×Pause。有创组测定的是气道阻力(RL)值。五、气道反应性的检测实验第32天,首先,连接好Buxco无创肺功能仪并定标。将自然状态下的BALB/c小鼠置入体描箱中,先测定基础Penh值;随后用Mch激发,浓度由低到高依次为0、0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50g/L,记录此时的Penh值,每次雾化吸入2min,记录3min。有创组则是将小鼠行气管插管后用Buxco有创肺功能仪测定其RL值。六、气道炎症气道反应性检测后行支气管肺泡灌洗(PBS0.8ml×3次),回收支气管肺泡灌洗液,离心,细胞沉淀重悬,取部分计算细胞总数,余下部分制备涂片,HE染色后行细胞分类计数,每张涂片计数400个细胞,记录各种细胞数目。七、统计学处理实验结果以Šx±s表示,为进行无创组和有创组气道反应性相关分析,分别将每个Mch激发浓度下的Penh与RL组转换为与NS激发的基础值的百分比(Mch激发的Penh值或RL值/NS激发的Penh值或RL值×100%)来表示。采用SPSS11.0统计软件分析,两组样本均数进行t检验或相关分析,P0.05、P0.01表示差异有统计学意义。结果一、小鼠的气道反应性小鼠在各浓度级Mch激发下,各组RL变化各异,具体见表1。Penh升为基础水平2倍时的Mch浓度定为PC100。无创哮喘组PC100均≤6.25g/L,对照组PC100均≥12.5g/L。具体分布见表2。无创哮喘组Log2(10PC100)值(5.36±0.84)显著低于对照组(7.97±0.82)(P0.01)。表1各浓度级Mch激发下各组的平均气道阻力组别Mch(g/L)基线生理盐水0.200.390.781.563.126.2512.5025.0050.00无创对照组0.480.450.460.490.450.520.520.540.771.392.03无创哮喘组0.450.460.520.490.520.650.961.382.413.905.25有创对照组1.571.611.681.852.212.412.613.