第七章-蛋白质翻译后修饰与加工

第七章蛋白质翻译后修饰与加工蛋白质翻译后修饰,是指在mRNA被翻译成蛋白质后,对蛋白质上个别氨基酸残基进行共价修饰的过程.蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用.人类基因组计划的完成是20世纪最伟大的科技成果之一。在对人类基因组进行仔细研究后发现,人类基因大约有30000-50000个，这仅仅是线虫和果蝇染色体基因数的3-5倍.而生命体内复杂生命过程的调控,仅仅靠这样小数目的基因远不能满足需要。因此,蛋白质翻译后修饰过程尤为重要，它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。细胞内许多蛋白质的功能,是通过动态的蛋白质翻译后修饰来调控的;细胞的许多生理功能,例如细胞对外界环境的应答,也是通过动态的蛋白质翻译后修饰来实现的。人类生命过程的复杂性不单是基因直接表达的结果,正是蛋白质翻译后修饰,使得一个基因并不只对应一个蛋白质,从而赋予人类生命过程更多的复杂性.在真核动物细胞中有20多种蛋白质翻译后修饰过程，常见的有泛素化、磷酸化与去磷酸化、糖基化与去糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。近年来,随着人类基因组和蛋白质组学工作的开展,关于蛋白质翻译后修饰的研究也取得一系列进展.磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程;糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用;脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用;组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立存在的。原核生物中肽链起始合成时，N端为甲酰甲硫氨酸，真核肽链合成时N端是甲硫氨酸，但是成熟的蛋白质中N端并无甲酰甲硫氨酸，大多数蛋自质的N端也不是甲硫氨酸。在生物合成过程中新生的肽链N端由去甲酞基酶去除甲酰甲硫氨酸残基的甲酰基，氨肽酶去除N端甲硫氨酸或N端某些氨基酸残基。一些分泌性蛋白质、激素及酶最初合成的是不具有生物活性的前体，如白蛋白原、胰岛素原等。蛋白质前体要经过蛋白酶切割，去除一部分肽段后才具有活性。它可以分为两种类型：①蛋白质前体在细胞内被加工成有生物活性的蛋白质，然后分泌到胞外；②蛋白质前体被分泌到胞外或消化道，被蛋白酶加工成有生物活性的蛋白质，如前胶原分子活化为胶原分子，胰蛋白酶原激活等。第一节蛋白质的糖基化大多数蛋白质以糖蛋白形式存在,它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白,功能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面。而且知道,病菌、病毒的侵染，癌细胞的增殖及转移,自身免疫疾病等都与细胞表面的糖密切相关。糖蛋白是蛋白质通过共价键与糖类结合的复合物，其中的糖基少则只有一个，多则可达数百个，后者的糖基常常连接成寡糖链，又称为聚糖（glycan）。1，糖肽连接键的类型一条寡糖链与蛋白质中氨基酸残基可通过多种方式共价连接，从而构成糖蛋白的糖肽连接键（简称糖肽键）。参与糖肽共价连接的氨基酸种类较少，常见的是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、羟赖氨酸、羟脯氨酸。O-糖肽键连接N-糖肽键连接GalNAc乙酰半乳糖胺GlcNAc乙酰葡萄糖胺Rolesofoligosaccharidesinrecognitionandadhesionatthecellsurface(2)凝集素的特异结合作用凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类：D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖；唾液酸。在植物凝集素中，只有麦胚凝集素（WGA）可专一结合唾液酸。细胞间的粘附是细胞间相互作用起决定性作用的起始步骤。作为致病的微生物，首先对宿主细胞进行粘着，然后才能感染和致病。细胞表面的凝集素能专一地识别并结合另一细胞的糖链。凝集素的这种特性，在细胞与细胞，细胞与基质的粘附中起一定作用。1990年11月，三个小组同时发现了血管内皮细胞－白细胞黏附分子1（ELAM－1），后改称E选择素（E-selectin），又称为动物凝集素，能识别白细胞表面的SLex(一种血型抗原)四聚糖。当组织受损或感染时，白细胞黏附于内皮细胞，沿血管壁滚动并穿过管壁进入受损组织，杀灭入侵病原物，但过多的白细胞聚集，则会引起炎症及类风湿等自身免疫疾病。美籍华裔科学家王启辉首先用酶法合成了SLex，并已由Cytel公司生产。Glycomed公司则从中药甘草中，找到了SLex的类似物甘草素，可用于封闭血管内皮细胞表面的E选择蛋白，从而达到抗炎的目的。Slex及其模拟物的结构（3）构成某些抗原的决定子聚糖与细胞和生物分子的一个很重要的特性就是表型和抗原性，据此细胞和分子能彼此区别，人类的ABO血型以及相关血型抗原性是由糖链决定的。A型和B型抗原决定簇的不同只是在于糖蛋白和糖脂中的糖链的非还原端的一个糖残基：A型为N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)；B型为半乳糖(Gal)。A型血的个体，他们的血液中含有抗B型糖链结构的抗体；B型血的个体，其血液中则有抗A型糖链结构的抗体。一旦输入不同血型的血液，就有可能引起免疫反应。O型血的个体的相应的糖链结构少了AB抗原非还原端的Gal或GalNAc。为此，这样的糖链结构不会和抗A或抗B的抗体结合引起免疫反应。这样的血型抗原物质不仅存在于一些红细胞的表面，而且也存在于一些表皮细胞的表面。三、糖蛋白的生物合成糖蛋白是复合蛋白，因此，糖蛋白的生物合成自然包括蛋白质的合成和糖链合成两个部分。糖蛋白中蛋白部分的合成和其他蛋白质的合成一样是在细胞质中的核糖体上进行，只是在肽链生物合成的同时或合成后，糖链作为一种翻译后加工的过程被接到肽链上的特定的糖基化位点。糖链的存在对肽链的折叠，糖蛋白的进一步的成熟、分拣、投送，以及最后的定位都有重要的影响。1，N-糖链的合成N-寡糖链前体的开始合成是在内质网进行，随后又在高尔基体内加工，全部合成大致可分为四步进行。（1）合成以酯键相连的寡糖链前体；（2）将寡糖链前体转移到正在增长着的肽链上；（3）除去寡糖链前体中的某些糖单位；（4）在剩余的寡糖核心上在加上另外的糖单位。1）寡糖链前体的合成2）寡糖链前体的转移在寡糖链前体生物合成后，被完整地转移到新生肽链的某些N-糖基化位点上（反应1），在合成过程中作为糖基载体的Dol-P-P被游离出来。Dol-P-P经磷酸酶水解释放出无机磷酸，变成磷酸长萜醇被循环使用。3）寡糖链前体的后加工转移到新生肽链上的寡糖链前体的后加工开始于内质网，首先由两个不同的-葡萄糖苷酶分别切除由Man延伸的3个Glc（反应2-3）和1个Man（反应4），随后尚未完成加工过程的糖蛋白被裹在由膜形成的囊泡中转移到高尔基体进一步加工。4）N-糖链的成熟N-糖链的成熟过程是在高尔基体内进行的。在糖蛋白通过高尔基体膜囊的途中，甘露糖残基已经过修剪，N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、岩藻糖以及唾液酸残基都根据需要连接到糖蛋白分子上，从而完成它的加工（反应1-7）。3，O-糖链的生物合成O-糖链的结构比N-糖链简单，但是种类比N-糖链多，肽链中可以糖基化的主要是丝氨酸和苏氨酸，此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸，连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子，后者可以和很多种单糖生成糖苷键，其中以通过GalNAc和丝氨酸或苏氨酸残基相连的O-糖链(以下简称为O-GalNAc糖链)研究得最多，这是因为这类O-糖链分布最广。为此O-糖链的生物合成中也以O-GalNAc糖链的生物合成研究得最详细。狗颌下唾液腺O-连接糖链的合成途径O-糖链生物合成过程最清楚的是黏蛋白的生物合成，黏蛋白是由颌下唾液腺分泌的一种O-连接糖蛋白，它的合成是在高尔基体中进行的。四、蛋白糖基化和去糖基化的化学调控在生物体内，大多数蛋白质都是以糖蛋白形式存在，它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白，涉及到细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发育、神经系统和免疫系统恒态维持等各个方面的功能。许多疾病的发生和发展，如炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等都与糖蛋白寡糖链的变化密切相关。因此，针对糖链的变化，利用小分子化合物抑制糖苷转移酶和糖苷酶的催化活性，可以控制糖链的合成和水解，从而达到治疗疾病的目的。糖蛋白的去糖基化酶去糖基化的目的有三:(一)检测碳水化合物在糖蛋白功能中的作用。(二)测定糖蛋白中蛋白质部分的分子量,尤其在重组DNA研究中,证明所产生的蛋白质是否为目的蛋白。(三)制备抗蛋白质抗体。去糖基酶有三类:外切型糖苷酶、内切型糖苷酶和糖胺酶(N-糖肽酶)。外切型糖苷酶能从糖链的非还原末端释放寡糖。例如:唾液酸酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄苷酶、α-L-果糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶等等。这些酶的应用有助于研究糖链的结构与功能的关系。例如:促红细胞生成素的去糖基化,当末端的糖即唾液酸、半乳糖、G1cNAc被专一性的糖苷酶去掉时,在体外测其活性逐渐提高,进一步切去内部糖链则导致活性丧失。内切型糖苷酶有如下几类：这些酶由于都是从糖链内部专一性切开某个键，因此在糖链结构分析以及结构与功能关系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶,，可应用于生物学的多个领域。例如：近年来内切型β-半乳糖苷酶结合单克隆抗体，免疫化学方法检测红细胞表面带有血型Ii-抗原的乳糖胺聚糖以及由聚乳糖胺修饰末端的各种抗原包括ABH和SSEA-1(Lex)，建立了正常人红细胞聚乳糖胺轮廓，并分析了遗传性贫血病人的不正常糖基化轮廓。发现这类病人的红细胞含增高的聚乳糖胺神经酰胺。和乳糖系列的糖脂,而其中有两条糖蛋白带很少被聚乳糖胺糖基化。这是一种糖基化缺陷病，现已对该病进行了广泛的分子生物学研究。糖胺酶(Glycoamidase,N-糖苷酶)，这类酶目前主要有两类:糖胺酶A(来自Almond)和糖胺酶F(来自flavobacteriummeningosepticum),都水解寡糖-G1cNAc-Asn-肽,释放出完整的寡糖,并且对寡糖结构特异性较宽,甘露糖型、复合型、杂合型糖链均可释放,包括所有含果糖基,含二分型Glc-NAc、β-木糖、Gal-GlcNAc重复单位以及含唾液酸基的N-乙酰乳糖氨型寡糖。但对肽分子专一性较强,只能释放含3-40个氨基酸的糖肽分子的糖基,对肽中氨基酸序列有一定要求。目前使用较多的为糖胺酶A,是分析N-糖链的有用工具,结合核磁共振,甲基化分析和外切型糖苷酶消化常用来定性分析由二维图谱分离的寡糖。1,α-葡萄糖苷酶抑制剂α-葡萄糖苷酶在机体的许多代谢过程中起着关键的作用，并与许多因代谢紊乱失调而引发的疾病有密切关系，如糖尿病、癌症、病毒感染等。对肠道α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的一些化合物已成为治疗糖尿病的一类新药，如已经上市的治疗糖尿病的拜糖平和米格列醇等。在寡糖链生物合成中，内质网内有两种α-葡萄糖苷酶催化寡糖链前体最末端的3个葡萄糖基，以利于N-寡糖链的形成。因此，能够阻断寡糖链生物合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂，也被用作抗病毒和抗肿瘤的药物。目前人们发现的-葡萄糖苷酶抑制剂可分为糖及其衍生物与非糖基化合物，其中糖及其衍生物按照已有文献分类，又可分为单糖类、双糖类、亚氨基糖类，碳糖与假糖氨类与硫糖类。其中研究比较多的-葡萄糖苷酶抑制剂属于亚氨基糖类（多羟基生物碱类）化合物，包括多羟基哌啶类、多羟基吡咯烷类、多羟基双稠吡咯烷类、多羟基吲哚里西啶类、多羟基去甲莨菪烷类、氨基环醇类等。作为抗肿瘤、抗病毒使用的-葡萄糖苷酶抑制剂，需要进入细胞内质网，所以必须增加化合物的疏水性，例如已经上市的N-丁基-1-脱氧尻霉素（N-丁基-DNJ）和生物碱粟精胺的衍生物，即6-O-丁酰粟精胺酯（6-O-butyl-cast）等，