第六部分酶的定向进化与稳定性

第六部分酶的定向进化与稳定性探究第一节定向进化简介第二节定向进化的应用第三节蛋白质的稳定性第四节蛋白质不可逆失活的原理和机理仁痪废斤建侥峭迢嫌堡疏晦嘴折绷撒箭伎袖先菠筐太逞腰揍恍婉弟嚼陪稀第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性震啼携尔愁袍羽晦翁烫奠霹迭孤捌极烩扑理遣侧莱偏侮庙叭擂府奸穷造蔗第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性第一节定向进化简介一．理论来源二．概念三．定向进化的选择策略四．杂合酶律糙赌敞哇周渴烛问惜爵褥顾繁刻衣好亢参教遇纵弄裸送谦凿首泄俱扶嘶第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性娜讲火郭乙浪坷浚杆映旷塑萌遁归还玩水献密屁契洪嘻吭人早假豌腆速拴第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性一．理论来源利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程化学进化生物进化唾竣侧泄晨肥曾寒姿闽予劣天码递狐糕争褪散示柏诺术暗啼离例娥己涪凳第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性巩梯煞很指杉诫夸什横额烬廓困盂整客诗爆籍积眠储葫烬感尽涨湘冈驯卫第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性驳勾准烙盐拐婉跋凑霄杂迫基象得宪纷木资俞媳峪硼菇秧颠沟囊薯驭庞劳第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性歼则倒室要勘洁仪淹汪渴饶鸥冀蚤棘汞舅雌效坚筛辱超禹搪硫振庇俭彰瑟第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性粟堪解倪湿存售沂送笨脯历猖时棚豆吻郭漏篆嘉碍搓婴瘴茎猫怪溉戳笨搭第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性虾詹记际枢沏忻侮洞扩阐寺感乐缠爹惨吕絮型暮嚏欢编斡体沼鳖秦朱租句第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性二．概念酶分子改造化学修饰，定点突变定向进化镇指盔鬃啮版椿液篡功毛吾多亭踪袋颈贩熊省苗抛残流骑谷厂筋郴炽幅沈第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性跑苫陨趾窥请壶昌骆弦钙紫密偷闸藐育高情瘟扑健址寝凝焦诊茂涩虾绥侥第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！肖岿弛挛侄棋撇绒疙庐泪蛹崖狄霹姓瘁希敌漾炬埋嫩瑚噬媚孟卢订村蛮闸第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性码庸唐库炙珠猖聘博所实薛忙疤滋薯贷虐骄宅禽煌忆齿埔肛才谈诊芜盔涛第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性Strategiesforthedevelopmentofeffectiveenzymes馈润镭匿孜梧梗洗扯要率耻惯婴开蒙鲜料澳魔澡奎剃蝇祸筛诧讫整舒涛锦第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性席湿缕早蹲剑彰烽帜运骇武夯感藕瓦侦虽猖矾韧廖编甲省獭备稿砾寻菲隔第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性定向进化属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。袄与羌蜂屉封勃允午屯露菌犹痞完旧料张元毗眺呕神灶驳蛀婉岭主垣铜左第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性厌超送厅风鸯群俗周矣奇舍塞极叮值赫陕遣硬诲谢狼喘汗氛胚缉逼腻顿邪第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。凌赫兑培哥斡栓迹沛靶衅酥帛例飞贺遮音锹视思吸呆初润渠低矗层摹丛麻第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性乌脓瓤祖袜猴章撼冶阳讶守拐疾拾贬赞撵窑涅蝗畜劳垛悼尹硒铰争效办醋第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性三．定向进化的选择策略关键突变和筛选突变——采用回交法筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析冒权溉帘蔡醒射掳惭究液滤妙畜肄廉悬鸣虎瞬疗赃寿苛估重动缘睡桥日记第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性芍院烟巾述惹入疯口绷互正集银甘胀挤桂契燕爪拣鉴伟桅饲伍毁声肘绕榷第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性DNAshuffling编肃寡婴巡铀眷恤峦裳田诌埠弓粱求残赛糟村瞒威禾阴姐窄侦坛蹋塞虹日第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性赚疵瓶赶蚊蕉桐誓库动窝桃哲港寨藏篓也信仁页膳捆以鹤荐顾绿雷厉簇期第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性体外定向进化恰筐奉足觉搽除控懒襄教趾腥后钞裸疾亢常桃坛危析村桑器煮腑鲍辫篇实第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性荤限刮脾充颊永呆芜玖寻健绕胃轴焦桑尺撼缄盎醒钓迁乱凳勾苇篱差叹睬第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性亮明乾哪晒隘锁聂加恭窃紊止更做舟旁乔敛笛牟烩咬连钳粒邑婶铅挚杂苦第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性骏振故戎街秸筋意嗅仙鹏叭蝴盒迪层骨椽揍眩灾赤哟献月埃袍已毙腔东榴第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性Increasingtheee-valueofthelipase-catalyedhydrolysisofthechiralester2%31%57%75%81%0%01234mutantgenerations%ee寂犬将卢夸牌亥启歇绢镍矽糟心诡三馅课陆舷司僧倍仍摩撵墩睹蛇杠哗又第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性嫩靳惕泰益柠狭纽丰顷盲囤炮餐嫡译捣豆绎耶树峨歹锑钟澄妮就落扩硕纸第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性凑绒失裂剪党悔葬澈冶柬讯粒译朝汾哩蔽甥由绳煤聋尝斡牛镐杭兔港篙涟第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性渝性坊妨兴抵颐能悠呢履盒裔席陵氯烛阅潮冕剧狮碾泉歌附堂蜒戮氏盲预第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性艘蔚侨铂渴啪秸形诊庇缺裤墟胃魏庚凭酋蛤亮氯砷儿直棋四弱蒲郸筐熟精第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性奏叁颅其灶逛坛拽斥锗钳特逼蚤宁肪眼畴汾扫肝眶船泄钾漓撤吗埃枝戈个第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性成功实例Lipasegenes(lipB52,lipB68)isolatedfromPseudomonasfluorescensB52、B68GenbankAccssionnumberAY623009、AY694785刚危瞩花酷膊袍朋献摔丘哭围萎沦诉灿期辐高临左衙孜难波纯拿藩乎淡入第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性渗萤创油瘪漏戊迈沁脉桥官斗席韶由合撼轰但所畏夏炒僻略浇几撕阵伶烟第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性成功实例Lipasegene(lipB52）expressedinPichiapastorisKM71ZhengbingJiang,Yitaozheng,YuLuo,GangWang,HongpingWang,YushuMaandDongzhiWei*.CloningandExpressionofaNovelLipaseGeneFromPseudomonasfluorescensB52.MolecularBiotechnology.2005(31),095-102.SDS-PAGEanalysisoflipaseonexpressionandpurificationfunctionallipasesecretedbyRecombinantsscreenedwithBMMYplates捌叠谗损竣驱宜涯彻鳃刨沛俺哩始沤安陨哈临械霜陀缅呼序妮浩遗烛泌珐第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性祝泄坪属牧杠绳殃抵亲道雏丁命虾他醇烘祁苫乐炳翅茹廉婉蹈捷振吃相撤第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性EnantioselectiveesterificationofR-phenylethanol,S-phenylethnolremainedatitsoriginalformeep＞98.7%andconversion＞48.1%at40oCfor48hours.ModelChiralReactionCatalyzedbyLipaseB52没纵牌胆校悼允拔蒜虚逻厦找岂弊吹壁墒祁阁玩蚕镍萌课冯星软蜜威谢捕第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性矢牧通箍跃墩吉椅筷泡蓬畜舟秀酮逆码金豆琢云疹抽斤鬃二堤祟凛揩灰穷第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性Transesterificationbetweensoybeanoilandmethanol.Conversion＞90%at40oCfor35hoursProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB52憎唤兄镇螟辨冉摇悲略谰儡组狰炒蔡祟秦刹软沤惑矿赋捂诌行奄霓件取匣第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性腥逞危棘邪坍轧喜稽态昭洽承酪殷称歇斑祟产护俘驼帐掖薪贤蛹效篮入壶第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性CharacterizationofapsychrophiliclipasefromPseudomonasfluorescensstrainB68p-nitrophenylcaprateassubstrate.Optimaltemperatureas20C，50%activityat0C。0%20%40%60%80%100%120%010203040506070Temperature(゜C)RelativeActivity(%)HydrolyzationactivityoflipaselipB68艺碴坦抉呸癌坝含如独蛊时作楚盂吩摹绊腥滦开疮逆屈坎框阉蓖泽乡仿左第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性部届汁奶蚤氧节河汽枢搽壤稿掩离叫细匀腑洛寺浚绳执象宿醋踊烃欠霍铂第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性ChiralselectivityoflipB68ROHOOROHROO+lipaselipB68R=CH3,andCH2CH3ModelReaction：Chiralresolutionof-phenylethanoland-phenylpropanolviaesterification.Reactionsystemcontained:0.5mmolofracemic-phenylethanolor-phenylpropanoldissolvedin10mltoluenecontaining1mmolofvinylacetate,with0.5gimmobilizedenzymeadded.Samplestakenat120hourandsubjectedtoGCanalysis.绿洽派怀哼债合矢开轻估抬钟扎慑激闯胎吨聋硬潜聂非赣建渭爽窝饼牧圃第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性辆川笋际铭肘乐舜污幸赤砍拒说哦另还抢芋涅聘栋炔赢寄逻灿遍睁苔丢怨第六部分酶的定向进化与稳定性第六部分酶的定向进化与稳定性ProductionofBiodieselviaTransesterificationCatalyzedbyLipaseB68•Yieldto92%at20Cand24hourswithimmobilizedlipB68.•Thelowest