液相教程之液相常见问题分析

©2008WatersCorporation液相色谱教程液相色谱教程液相色谱常见问题分析液相色谱常见问题分析©2008WatersCorporation2逻辑判断—将会节省解决问题的时间色谱问题的可能根源色谱问题的可能根源¡流动相¡进样器¡在线过滤器¡色谱柱¡检测器¡样品¡泵¡保护柱¡连接管线及接头¡软件¡其它偶然因素©2008WatersCorporation3机械因素解决色谱问题的策略解决色谱问题的策略¡色谱柱¡保护柱¡流动相¡样品/样品瓶问题¡泵¡进样器¡检测器¡数据采集¡谱带展宽/连接观察色谱图--尝试对问题进行分类简化问题--最先对最容易的部分进行故障排除问题化学因素©2008WatersCorporation4判断故障与故障排除的原则判断故障与故障排除的原则¡规则一：确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实是问题¡规则二：从最简单的因素入手¡规则三：一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联©2008WatersCorporation5判断故障与故障排除的原则判断故障与故障排除的原则¡规则四：恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费¡规则五：养成记录的好习惯。一个完整的好记录是成功地进行故障排除的关键©2008WatersCorporation6HPLCHPLC实验中常见问题分类实验中常见问题分类¡HPLC系统压力问题—压力高—压力低或没有压力—压力不稳¡流路基线噪音问题—基线不稳定(不重复)—长、短程振荡—基线漂移—噪音脉冲尖刺©2008WatersCorporation7关于色谱系统的反压关于色谱系统的反压¡什么是反压(backpressure)—流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,—又称系统反压或系统压力—Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋)—其它单位有:Bar,Mpa(1Bar=0.1Mpa=14.5Psi)¡影响系统反压的主要因素:—流动相的溶剂组成—温度—流速©2008WatersCorporation8反压与溶剂组成的关系反压与溶剂组成的关系Pressurevs.Organic-WaterPercentage02004006008001000120014001600020406080100PercentOrganicSolventpsiMeOHACN¡流动相的粘度是产生反压的主要原因¡有机溶剂－水的粘度随组成而改变¡其压力随组成变化如下图所示©2008WatersCorporation9反压与流速的关系反压与流速的关系¡流速对反压的影响是线性关系¡流速增加，反压亦增大¡下图的实验条件：—2.1×30mmSymmetryC18柱,20℃Pressurevs.FlowRateat20?C05001000150020002500300035004000450050000.00.20.40.60.81.01.2mL/minpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN©2008WatersCorporation10反压与温度的关系反压与温度的关系¡温度对反压的影响是反比关系¡温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些Pressurevs.Temperature050010001500200025003000350040004500500010.020.030.040.050.060.070.0Degrees,Cpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN©2008WatersCorporation11影响系统反压的其它因素影响系统反压的其它因素¡反压与色谱柱长度成正比¡反压与填料颗粒度的平方成反比—2.5μm填料比3.5μm填料反压高¡反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)¡反压与管路的长度成正比©2008WatersCorporation12HPLCHPLC系统压力问题分析系统压力问题分析(1)(1)¡问题:系统压力高¡可能的原因:—温度太低—流速太高—流动相粘度大—管路堵塞—仪器或色谱柱堵塞—压力传感器问题©2008WatersCorporation13¡问题:压力低或没有压力¡可能原因:—温度太高;流速太低—泵关闭或保险丝断了—泵未输送流动相—系统内有渗漏处—所用溶剂不正确—自动进样器在Purge时卡住HPLCHPLC系统压力问题分析系统压力问题分析(2)(2)©2008WatersCorporation14¡问题:压力低或没有压力¡可能原因:（续）—储液瓶中无溶剂—低压限设置不当—泵未正确排气—溶剂入口过滤头堵—入口管路中有空气—泵失效HPLCHPLC系统压力问题分析系统压力问题分析(2)(2)©2008WatersCorporation15¡问题:压力不稳¡可能原因:—压力传感器问题—泵排气不充分—泵失效—流动相未正确脱气—所用溶剂不混溶或易挥发HPLCHPLC系统压力问题分析系统压力问题分析(3)(3)©2008WatersCorporation16¡基线不稳定(不重复)—检测池中有大的气泡—流路中有小气泡流过—系统未稳定或未达到化学平衡—流动相被污染—检测器流动池漏—色谱柱污染HPLCHPLC流路基线噪音问题分析流路基线噪音问题分析©2008WatersCorporation17¡基线漂移—系统不稳或未化学平衡—温度波动—流动相未正确脱气—流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化—检测器流动池漏;系统中有渗漏—色谱柱污染;固定相渗漏—选用不正确的检测波长(相对于溶剂)—有迟流出的组分HPLCHPLC流路基线噪音问题分析流路基线噪音问题分析©2008WatersCorporation18¡短程振荡—泵压不稳—泵入口管松,弯或堵塞—溶剂混合不充分—检测池中有大气泡—泵入口阀脏或失效—泵柱塞杆密封垫磨损—检测器出口溶液成滴状流入废液瓶HPLCHPLC流路基线噪音问题分析流路基线噪音问题分析©2008WatersCorporation19¡长程振荡—温度波动—溶剂被循环通过系统¡噪音脉冲尖刺—流路中有小气泡—泵头有气泡空腔—入口阀脏或失效—检测池中有小颗粒物—泵或检测器未正确接地HPLCHPLC流路基线噪音问题分析流路基线噪音问题分析©2008WatersCorporation20无规律基线噪音无规律基线噪音¡气泡-流动相脱气¡气体滞留在检测器中—流动相脱气—对检测池加一定的反压¡泄漏-修复泄漏，更换接头¡混合问题-增加系统体积¡管线阻塞—疏通管线，冲洗系统¡电问题—改变电路，去除根源©2008WatersCorporation21有规律的基线噪音有规律的基线噪音¡几乎都由色谱泵引起¡泵头中有气泡–做泵排气并重做溶剂脱气¡单向阀脏或失效-清洗或更换之¡柱塞杆密封垫漏液-更换¡柱塞杆损坏-更换¡混合问题-增加系统体积¡电噪音-改变电路，去除根源©2008WatersCorporation22色谱图常见问题分类色谱图常见问题分类¡色谱图常见问题主要有三类:—色谱峰峰形异常问题o例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等—色谱图中多峰少峰问题o色谱图未出峰,出峰比预想的多等—色谱峰保留时间问题o保留时间不稳定等©2008WatersCorporation23¡HPLC最常见的问题¡表明目前状况并未得到最佳的色谱柱性能¡变形的色谱峰会导致:—积分不准—分离度不佳—灵敏度下降色谱图峰形问题色谱图峰形问题©2008WatersCorporation24色谱图峰形问题示例色谱图峰形问题示例40分1234512345正常不正常1.尿嘧啶2.心得安3.萘4.二氢苊5.阿米替林©2008WatersCorporation25色谱峰形问题的来源色谱峰形问题的来源¡色谱柱毁坏¡溶解样品的溶剂不当¡第二种相互作用¡色谱柱过载—质量过载—体积过载¡其它柱外效应—管路连接—采样速率—时间常数©2008WatersCorporation26良好填装的色谱柱色谱柱状态色谱柱状态——机械因素机械因素填料平齐©2008WatersCorporation27填装良好的色谱柱良好的色谱结果良好的色谱结果表明:系统、色谱柱、连接状况皆良好©2008WatersCorporation28峰形问题峰形问题::色谱柱塌陷色谱柱塌陷柱头有死体积-Channeling填料塌陷©2008WatersCorporation29色谱柱填料塌陷色谱柱填料塌陷((产生死体积产生死体积))所有的峰都变形！¡可能的原因:—振动使柱床破坏—高pH流动相使填料颗粒溶解©2008WatersCorporation30色谱峰形欠佳的其它原因色谱峰形欠佳的其它原因¡色谱峰形问题：展宽且拖尾的色谱峰—色谱柱进口过滤器(筛板)部分阻塞o卸下接头—在线过滤器污染o更换筛板—保护柱污染o更换保护柱或柱芯©2008WatersCorporation31(Toostrong)Column:SymmetryShieldRP18,3.5μm,3.9x150mmGuardColumn:SymmetryShieldRP18,5μmTemperature:30°CMobilePhase:0.1%TFA:Methanol(60:40)FlowRate:1mL/minInj.Volume:30μLSampleIdentification1.EDDP2.Diphenhydramine(IS)3.Methadone15所有的色谱峰都变形所有的色谱峰都变形51510Min.样品溶解在水中0.04AU123样品溶于80%MeOH及2%HAc中1230.02AU样品溶剂强度强于流动相Detection:UVat210nm化学问题:溶解样品的溶剂不当©2008WatersCorporation32Minutes0510152025部分色谱峰形不正常部分色谱峰形不正常§积分误差§分离度降低§灵敏度降低¡可能的原因:—振动使柱床破坏—高pH流动相使填料颗粒溶解©2008WatersCorporation33碱性物质峰拖尾碱性物质峰拖尾时间(分钟)50普通C18现代C18中性物质碱性物质中性物质碱性物质0pH7¡不同品牌色谱柱的硅醇基活性的差异¡pH因素©2008WatersCorporation34拖尾是由什么引起的拖尾是由什么引起的??NRON1H2R3SiONaSi-H1R23++-+RRRCl-+Na+Cl-+¡混合型保留机理-第二种相互作用—与键合相的疏水作用—与硅胶带电点的离子交换作用©2008WatersCorporation35缓冲液的缓冲液的pHpH与拖尾与拖尾缓冲液pHT12342345678传统C18现代C18理想状况©2008WatersCorporation36色谱峰形异常问题分析色谱峰形异常问题分析(1)(1)¡所有的峰均为负峰—信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒—光学装置尚未达到平衡¡一个或几个峰是负峰—流动相吸收本底高—进样过程中进了空气—离子对分离中的系统峰—样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相©2008WatersCorporation37色谱峰形异常问题分析色谱峰形异常问题分析(2)(2)¡所有的峰都是宽峰—系统未平衡或未达到化学平衡—溶样的溶剂比流动相强很多—色谱柱类型或尺寸不正确—色谱柱或保护柱被污染或降级—温度变化对色谱柱的影响©2008WatersCorporation38色谱峰形异常问题分析色谱峰形异常问题分析(3)(3)¡较早洗脱的峰呈宽峰—进样体积过大或样品浓度太高—进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适—在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞—管路问题:内径不对或切管不正确—管路连接问题:接头或锥箍不正确—检测器时间常数不正确©2008WatersCorporation39当上样量超过一定限度时发生–注意峰起点提前进样6.25µg2Minutes分析规模上样量(6µg)获得良好的色谱峰形46AbsorbanceAbsorbance进样