您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 行业资料 > 国内外标准规范 > 12月最新中文版cas9中文版综述
HansJournalofAgriculturalSciences农业科学,2014,4,142-150PublishedOnlineDecember2014inHans.://dx.doi.org/10.12677/hjas.2014.46022142AdvancesinGenomeDirectionalEditingTechnologiesofCRISPR/Cas9YaoYao,XueyanQian,DongquanGuo*Agro-BiotechnologyResearchInstitute,JilinAcademyofAgriculturalSciences,ChangchunEmail:*xzgdq@126.comReceived:Nov.18th,2014;revised:Nov.25th,2014;accepted:Dec.8th,2014Copyright©2014byauthorsandHansPublishersInc.ThisworkislicensedundertheCreativeCommonsAttributionInternationalLicense(CCBY).(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated)referstoanadaptiveimmunesystemthatisgainedfromthelong-termevolutionoftheorganismwhichiswidespreadinbacteriaandarchaea.ThesystemisabletodegradetheinvadingvirusorphageDNA.TypeⅡofCRISPR/Cassystemhasbecomethemostpopularmethodduetoitssimplicity.Thispapersummarizesthebasicstructure,principle,technicalcharacteristicsandtheprogressofCRISPR/Cas,aswellastheapplicationprospectofthetechnology.KeywordsCRISPR/CasSystem,Cas9Protein,TargetedGenomeModification基因组定向编辑技术——CRISPR/Cas9的研究进展姚瑶,钱雪艳,郭东全*吉林省农业科学院农业生物技术研究所,长春Email:*xzgdq@126.com收稿日期:2014年11月18日;修回日期:2014年11月25日;录用日期:2014年12月8日*通讯作者。基因组定向编辑技术——CRISPR/Cas9的研究进展143摘要CRISPR/Cas系统(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated)是广泛存在于细菌及古生菌中的,由细菌体长期进化而形成的,能够降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。由于CRISPR/Cas的Ⅱ型系统比较简单,因此成为目前应用最为广泛的方法。本文主要介绍了CRISPR/Cas系统的基本结构、作用原理、技术特点、研究进展以及该技术可能的应用前景等方面内容。关键词CRISPR/Cas系统,Cas9蛋白,基因定点修饰1.引言随着测序技术的不断进步,越来越多物种的全基因组序列被获得。面对这些海量的基因数据,基因定点编辑技术将是能够高效寻找目标基因,迅速获得基因功能和应用信息,使这些生物基因信息充分得到利用的重要研究手段。基因定点修饰是指外源DNA片段与受体同源片段发生重组,使外源DNA片段整合到染色体的目标位点,与通常的T-DNA标签、转座子标签及逆转座子标签等基因敲除技术相比,基因定点修饰技术不仅能实现基因准确的定点整合,而且可对靶基因进行精细改造如缺失或插入[1]。目前常用的基因组定点编辑技术包括:锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases,ZFNs),转录激活因子效应物核酸酶(Trans-criptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs),以及近年来兴起的一项新技术——成簇的规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)/Cas9系统三种编辑技术[2][3]。同ZFNs和TALEs技术相比,CRISPR/Cas9优势在于:该技术以短RNA作为DNA序列的识别序列;识别位点的要求比较多样化;不需形成二聚,仅Cas9蛋白即可完成与FokI酶的功能相似的作用;可一次断裂多个位点;成功率高;对细胞毒性小;应用成本便宜等明显的优势[4][5]。2.CRISPR/Cas技术2.1.CRISPR技术研究历史1987年,日本学者研究E.coliK12的碱性磷酸酶基因时,在其编码区的附近首次发现了成簇的规律间隔的短序列,这些序列由14个长度为29bp的重复片段和32~33bp的非重复片段间隔连接[6]。然而这一发现,在当时并未得到足够的重视。随着测序技术的不断成熟,研究人员发现这种间隔重复序列广泛存在于各种细菌和古细菌中。到了2002年,这一独特的序列才被科学家Jansen等[7]将其正式命名为:成簇的、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR),CRISPR与其关联蛋白(CRISPR-associatedproteins,CAS)共同组成了CRISPR/CAS系统。研究发现已经测序过的细菌基因组中约有40%都存在CRISPR位点[8]。在自然界中,噬菌体与细菌之间是一种捕食与被捕食关系。其中烈性噬菌体是细菌的天然“杀手”,具有杀死和清除细菌的能力。为了躲避噬菌体的攻击,细菌不断的进化出一些防御机制,根据噬菌体侵入宿主的不同阶段,可以将噬菌体抵抗机制分为4个主要类别:吸附抑制,流产感染,限制–修饰系统和穿入阻滞。另外,还有利用噬菌体编码的抗性作用,以及通过人工插入突变的方法获得广泛的噬菌体抵抗菌株[9]。近年来,新兴起的CRISPR系统也是细菌抵御质粒或噬菌体等外源物质侵入的一种适应性免疫防御机制。基因组定向编辑技术——CRISPR/Cas9的研究进展144在2005年,3个独立的研究小组几乎同时发表文章[10]-[12]称,经过对CRISPR重复序列进行分析比较后得出,CRISPR系统可能是细菌抵御质粒或噬菌体等外源物质侵入的一种适应性免疫防御机制。直到2012年,由RNA导向的基因组编辑技术CRISPR/Cas9(CRISPR/CRISPR-associate9)技术才发展起来[13]。2.2.CRISPR技术的基因结构CRISPR是一个由高度保守的、短的DNA正向重复序列(Repeats)组成特殊的重复序列家族,广泛分布在各种细菌和古细菌基因组中[14],这些重复序列的长度通常在21~48bp之间,因具有回文序列,可以形成发卡结构,这些序列的重复次数最高可达250次[15]。每个重复序列之间均被与之相似的26~72bp左右、长度不等或长度相似的非重复序列间隔开,称作间隔序列(Spacer),这些间隔序列长度与细菌种类和CRISPR位点有关[16]。CRISPR通过这些间隔序列对靶基因进行识别。在CRISPR第一个重复序列上游有类似于启动子功能的CRISPR前导序列(Leadersequence),主要用于启动CRISPR序列的转录[17],转录产生的非编码RNA被命名为crRNAs(CRISPRRNAs)[18][19]。而后,这些crRNA前体和CRISPR序列附近的Cas蛋白共同参与CRISPR免疫防御过程。此外,在CRISPR位点附近存在着一组由4~10个保守的CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgenes,Casgenes)组成的序列,称为CASs(CRISPR-associatedsequences,CASs)[15]。最终,由重复序列、间隔序列、前导序列和Cas蛋白基因共同构成了CRISPR/Cas系统。2.3.CRISPR/Cas技术结构按照已测序的大约40%的细菌和90%的古细菌中的CRISPR/Cas系统的结构特点,该系统可分为三大类型:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[20][21]。类型Ⅰ:在细菌和古菌中均存在,在Cas3核酸酶的作用下对入侵的外源DNA进行切割降解;类型Ⅱ:目前仅在细菌中被发现,由Cas9核酸酶参与,不需要复杂的蛋白复合体,参与CRISPR中RNA的加工及剪切外源基因的过程;类型Ⅲ:主要存在于古菌中,分为ⅢA和ⅢB两种亚型,主要功能是参与间隔重复序列转录过程及降解靶基因[22]-[24]。其共同特点是RNA介导的核酸酶能够特异性地切割外源入侵的DNA,包括噬菌体和质粒DNA[25]。从整体来看,Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统切割DNA双链时需要由多个Cas蛋白所形成的复合体进行操作,而Ⅱ型CRISPR/Cas系统仅需要由1个Cas9蛋白作为切割DNA双链的工具。因此,仅在Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA和RNaseⅢ这四种组分的共同作用下即可完成DNA双链切割过程。因此,Ⅱ型CRISPR/CAS系统,因其工作组分比较简单,被广泛应用于基因编辑或基因沉默[26]。2.4.CRISPR/Cas技术进行基因编辑的基本原理当噬菌体入侵细菌时,依赖于原间隔序列毗邻(proto-spaceradjacentmotif,PAM)元件对外源DNA与自身基因组进行区别,入侵DNA被识别;Cas9是包含两个切割域(Ruv和HNH)的双链DNA酶,两个切割域分别切割靶DNA的一条链;Cas蛋白复合物靶向裂解入侵基因组中的原间隔序列(protospacer)[27],将该基因组上一段大小约为20bp的片段将作为新的间隔序列插入到宿主细胞的CRISPR序列的起始序列之后,形成宿主细胞中新的第一个间隔序列,从而使细菌体能够对该序列进行储存识别。当宿主细胞再次受到该类型噬菌体入侵时,细菌利用新形成的CRISPR序列可以迅速响应,转录生成一条长链crRNA前体(pre-crRNA),随后由Cas蛋白复合体在tracrRNA(trans-activatingcrRNA)的共同作用下剪切形成成熟体crRNAs,其中,每个crRNA都包含一个由单个间隔序列转录而来的区域,最后形成tracrRNA-crRNA-Cas9复合体识别并剪切与crRNA互补的位点[28][29]。基因组定向编辑技术——CRISPR/Cas9的研究进展145另外,CRISPR/Cas系统中Cas9的两个核酸酶结构域(Ruv和HLH)是该系统的基本组成成分,其中D10A和H840A位点发生突变,Cas9蛋白将会失去对DNA的切割活性,但并不影响其与DNA结合的能力。这种失去DNA切割活性的Cas9蛋白被命名为dCas9(DeadCas9)。在靶向基因gRNA同dCas9在细胞中共表达时,则sgRNA可以介导二者的结合。若dCas9在靶基因的阅读框内结合,则可阻断RNA聚合酶(RNApolymerase,RNAP)的延伸作用;如果dCas9在靶基因的启动子区域结合,就可以阻止基因转录的起始[30][31]。2.5.CRISPR/Cas技术特点在Cas9系统发挥识别剪切过程中,tracrRNA首先与crRNA形成tracrRNA-crRNA复合体,接着,Cas9蛋白识别并与tracrRNA-crRNA复合体结合,然后在crRNA的引导下识别并切割靶位点。为
本文标题:12月最新中文版cas9中文版综述
链接地址:https://www.777doc.com/doc-4196498 .html